De cristalización de proteínas para la cristalografía de rayos X

El objetivo general de este procedimiento es producir cristales de proteínas para experimentos de difracción de rayos X aquí. Se demuestran tres técnicas diferentes para el cribado de cristales: se describen los métodos de cristalización por difusión de vapor, que incluyen gota colgante y gota sentada, así como los métodos de cristalización por microlotes para la cristalización por difusión de vapor. Los pozos están llenos de precipitante.

A continuación, se mezcla una muestra de proteína purificada con el agente precipitante. A continuación, la gota mezclada se sella en un pocillo que contiene la solución precipitante. La cristalización de micro lotes comienza con el llenado del pozo con aceite de parafina.

A continuación, la proteína se carga en los pocillos, seguida de la solución precipitante. El paso final de todos los métodos es dejar que el sistema se equilibre y seguir la apariencia y el crecimiento de los cristales dentro de las gotas. En última instancia, se pueden obtener cristales a partir de esta técnica y el patrón de difracción de proteínas se puede determinar utilizando una fuente de rayos X con un detector adecuado.

Hola, soy Sal del laboratorio del profesor Yoga Motis en el Departamento de Biofísica Molecular y bioquímica de la Universidad de Yale. Hoy te mostraremos un procedimiento para la cristalización de una proteína purificada. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las bases estructurales de la infección viral.

Así que comencemos y cultivemos algunos cristales. Para identificar un método de cristalización para una macromolécula de elección, se pueden realizar cribados iniciales utilizando soluciones de cristalización disponibles en el mercado que se eligen para explotar el método factorial incompleto de matriz dispersa de las condiciones de ensayo. Estas condiciones se seleccionan en función de las condiciones de cristalización conocidas y comúnmente exitosas para las macromoléculas.

Una vez que se conoce la condición de cristalización, se puede ensamblar una pantalla estrecha que varía la concentración de precipitante en pH alrededor del golpe original. Por lo general, las condiciones de cristalización utilizadas para estas pantallas consisten en un asalto de agente precipitante y un tampón para establecer el pH, todas las soluciones madre deben filtrarse a través de un filtro de 0,22 micras para esta demostración. Las condiciones de cristalización previamente identificadas para el lisosoma de pollo se utilizan con cloruro de sodio como precipitante, comience el procedimiento preparando soluciones de un mililitro de varias concentraciones de cloruro de sodio en acetato de sodio 0.1 molar de varios phs.

A continuación, descongele, la muestra de proteína se almacena a menos 80 grados centígrados y manténgala en hielo. Las concentraciones típicas de proteínas están en el rango de cinco a 50 miligramos por mililitro con concentraciones más altas, lo que generalmente da mejores resultados. En este caso, se utiliza una solución de 50 miligramos por mililitro de lisosoma de huevo de gallina en acetato de sodio 0,02 molar pH 4,9.

Centrifugar la muestra durante 15 minutos a 18.000 g y cuatro grados centígrados para eliminar las proteínas parcialmente agregadas o precipitadas de la etapa de descongelación. Estos agregados pueden interferir con el crecimiento de los cristales y promover una mayor agregación. Después de la centrifugación.

Determine la concentración de proteínas a partir de su absorbancia a 280 nanómetros utilizando un fotómetro de espectros UV. La concentración de proteína se puede calcular a partir de la lectura de absorbancia y el coeficiente de extinción de la proteína. Una vez que la muestra de proteína esté lista, llene una bandeja de cristalización de gota sentada colgante de 24 pocillos con 500 microlitros de solución precipitante de acuerdo con el mapa de la bandeja.

Cree un anillo de grasa de silicona alrededor del borde de cada pocillo sin cerrar perfectamente el anillo para que el aire pueda escapar por el pozo. Techo. Limpie el portaobjetos de la tapa con spray de aire condensado o una toallita profesional para evitar el polvo, lo que facilitará la interpretación de las gotas de cristalización y eliminará las contaminaciones. El siguiente paso es pipetear volúmenes iguales de la muestra de proteína y la solución del depósito en el portaobjetos de cubierta.

Sin embargo, se pueden probar diferentes volúmenes de proteína y precipitante como parte del proceso de optimización utilizando más proteína que precipitante, lo que da como resultado una concentración neta de la proteína en la gota equilibrada, lo que puede ser deseable para muestras de proteína dute o para ralentizar la nucleación o el crecimiento de cristales. Para esta demostración, se utilizaron dos microlitros de 50 miligramos por mililitro de lisozima en acetato de sodio de 0,02 molares. Se carga cuatro de pH en el centro del portaobjetos de cubierta, seguido de dos microlitros de solución de cristalización.

Al pipetear la proteína y la solución del depósito en el portaobjetos de la cubierta, tenga mucho cuidado para evitar la formación de burbujas, que a menudo ocurre cuando se expulsa aire de la pipeta. Mezcle suavemente la gota para ayudar a prevenir la precipitación prematura de proteínas debido a las concentraciones localmente altas de precipitantes en la gota. La mezcla es particularmente importante para precipitantes viscosos como el polietilenglicol usando pinzas. Voltee la corredera de la tapa suavemente y colóquela sobre el anillo de engrase en la parte superior del pozo y hágalo de manera direccional para que el aire pueda escapar del pozo.

De lo contrario, el aire puede levantar la corredera de la cubierta comprometiendo el sello del pozo. Pase al siguiente pozo hasta que la bandeja esté completa. Una vez que se haya configurado la bandeja, inspeccione visualmente, eliminando las partículas de polvo y otros contaminantes que pueden reducir la identificación de falsos positivos de los cristales de proteínas.

Utilice una hoja de puntuación para documentar el experimento. A continuación, coloque la bandeja a la temperatura de incubación deseada, generalmente entre cuatro grados centígrados y temperatura ambiente. La temperatura más exitosa es de 20 grados centígrados.

Tenga cuidado de manipular la bandeja con cuidado y evite los temblores, las vibraciones o los cambios de temperatura durante la transferencia o la incubación pueden impedir el crecimiento de cristales o afectar negativamente a su calidad. Revise la bandeja en busca de cristales al día siguiente y luego cada pocos días, siempre manipulando las bandejas con cuidado. Documente los hallazgos y las morfologías de las gotas en una hoja de puntuación específica de la bandeja.

Los cristales suelen tardar de dos a cinco días en aparecer, aunque ocasionalmente aparecen casi de inmediato o hasta varios meses después. Una vez que se han identificado las condiciones de cristalización y se conoce la tasa de crecimiento de los cristales, es mejor dejar las bandejas sin alterar hasta que los cristales hayan aparecido y hayan crecido hasta al menos la mitad de su tamaño final. Dejar las bandejas sin alterar puede reducir el número de eventos de nucleación de cristales, lo que resulta en un menor número de cristales más grandes para la cristalización de gotas sentadas que sigue el mismo procedimiento que para la caída colgante, excepto que usaremos una bandeja de caída de 24 pocillos en la que no se requieren portaobjetos de cubierta.

En cambio, el pozo contiene un estante en el que se mezclan la proteína y el precipitante, dos microlitros de 50 miligramos por mililitro de solución de lisozima en el centro del estante, evitando la generación de burbujas de aire. A continuación, agregue dos microlitros de solución precipitante a la muestra después de la configuración de la bandeja. Selle los pozos con cinta óptica con caída sentada.

No son necesarias correderas de cubierta. Continúe la incubación y el marcado de cristales como se describe para colgar la gota. Para realizar un procedimiento de micro lotes.

Prepare la solución de cristalización y la proteína como se describe para el procedimiento de gota colgante. Obtenga una nueva bandeja de micro lotes y rociador de aire para evitar polvo y otras partículas grandes en la bandeja de micro lotes. Agregue aceite de parafina a cada pozo a una profundidad de tres milímetros.

A continuación, retire el exceso de aceite. A continuación, cargue un microlitro de la solución de proteína en el pocillo prellenado, asegurándose de que la gota se hunda hasta el fondo del pocillo. Luego cargue un microlitro de solución precipitante en el pozo.

Asegúrese de que la gota se hunda hasta el fondo del pozo y se fusione con la gota de proteína. Pase al siguiente pozo hasta que la bandeja esté completa y continúe con la incubación y el análisis de cristales como se describe aquí. Resultados típicos de la cristalización de proteínas.

Se muestran experimentos. La precipitación amorfa ocurre cuando la proteína y/o el precipitante están en alta concentración. Por el contrario, las gotas insaturadas suelen permanecer claras.

La separación de fases puede ocurrir si la proteína o el detergente se separan a una fase diferente cuando se mezclan con ciertos precipitantes a alta concentración. En condiciones óptimas, los cristales de proteína deberían formar Arabidopsis csn. Siete cristales de proteínas que se obtuvieron en polietilenglicol 8.000 y acetato de magnesio aparecen en forma de bastón.

También se muestran cristales de proteína lisosoma que se obtuvieron en un molar, cloruro de sodio y acetato de sodio. pH 4,9. Esta película de lapso de tiempo demuestra que los cristales de lisosoma se convierten en grandes prismas a las pocas horas de la configuración cuando se usa el método de gota colgante.

Acabamos de mostrarte cómo configurar un experimento de proteínas cuando estás haciendo este procedimiento. Es importante trabajar en un ambiente que tenga un control constante de la temperatura y la humedad, ya que una alta humedad ayuda a minimizar la evaporación de la gota, trate de adoptar una técnica que minimice la exposición de la gota al aire libre. Por esta razón, es esencial operar en un entorno de trabajo bien organizado.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.