Name: Perfiles de isótopos estables de flujo intermediarios metabólicos en fase de desarrollo y de Adultos Caenorhabditis elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Aprende a realizar perfiles de isótopos estables en Caenorhabditis elegans para analizar flujo metabólico en glicólisis y ciclo de Krebs. Este método permite cuantificar alteraciones genéticas y farmacológicas en nematodos.

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Este trabajo fue financiado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (K08-DK073545 NICHD y patrocinado por la investigación intelectual y Deficiencias del Desarrollo Centro de Premio al Investigador Nuevo), la Fundación Filadelfia, y la Universidad de Pennsylvania premio McCabe (MJF), así como la de Tristán Mullen Fondo (MJF y MI). El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

<ol><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%3A+A+practical+approach%22">C. elegans: A practical approach</a>. , University Press. Oxford. (1999).</li>
<li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li>
<li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chromatography%22%5BJournal%5D)">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li>
<li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li>
<li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).</li>
<li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li>
</ol>

La aplicación de la espectrometría de masas para medir la abundancia isotópica de metabolitos intermedios ofrece una imagen maravillosamente detallada de los cambios bioquímicos críticos 5. En este caso, hemos proporcionado protocolos detallados para la explotación de esta metodología altamente sensible y específica para evaluar el flujo intermediario metabólico en el modelo animal genéticamente versátil, C. elegans. De hecho, la alimentación de los animales que viven con isótopos estables etiquetados precursores metabólicos (por ejemplo, 13 C-glucosa) permite la visión novedosa en el flujo vía intermediarios metabólicos en la medición de enriquecimiento isotópico en los metabolitos intermedios. Hemos desarrollado una metodología fiable para obtener un análisis sólido de flujo a través de la glicólisis, el metabolismo del piruvato y el ciclo del ácido tricarboxílico. Esto se puede lograr tanto en los animales alimentados con isótopos estables de las primeras etapas del desarrollo larval o principios en el período post-mitótico adultos. Enriquecimiento isotópico en diferentes especies de metabolitos pueden ser estudiadas en conjunto con el gusano entero sin perfil de aminoácidos por cromatografía líquida de alto rendimiento, como se describió anteriormente 4, para determinar el enriquecimiento isotópico absoluta en las diferentes especies de gusano de alanina libre, aspartato, glutamato y la glutamina. De hecho, los patrones consistentes de enriquecimiento isotópico se obtienen al medir los aminoácidos y ácidos orgánicos analitos en alícuotas de entre 1.000 y 2.000 jóvenes gusanos adultos sincrónica. Dicha metodología sensible puede discriminar el flujo anormal de intermediario en el gen nuclear basada en las cepas mutantes mitocondrial en relación con los gusanos de tipo salvaje. Esta técnica tiene un valor para investigar las alteraciones del flujo de vías bioquímicas específicas de interés común de los errores innatos del metabolismo. En particular, la utilización de la glucosa marcada con isótopos estables informa el flujo de carbono por el centro de las rutas metabólicas de interés para la enfermedad mitocondrial. De hecho, nuestros datos sugieren la aplicación de dicha metodología sensible puede discriminar flujo intermediario anormal en un gen nuclear basado mitocondrial subunidad compleja cepa mutante III (ISP-1 (qm150)) en relación con los gusanos de tipo salvaje. Es importante reconocer que, desde la exposición isotópica se completa en un período de uno a varios días, el enriquecimiento isotópico cuantificados representa un &quot;estado estable&quot; valor de enriquecimiento y no cuantificables de flujo durante un período definido de tiempo que pudieran determinarse en la celda de los modelos basados ​​en expuestos a los isótopos de un periodo de minutos a horas. Otra limitación potencial de interrogar a la vía de flujo a lo largo del desarrollo de los nematodos se relaciona con diferentes longitudes de desarrollo de las larvas que se producen, en particular, cepas mutantes. Por ejemplo, muchas mutaciones mitocondriales severas son conocidos por causar un paro en la tercera (L3) estado larval 6. Así, el análisis de la incorporación de isótopos sólo en los animales que sobreviven a la edad adulta puede no ser representativa de la población mutante todo. Sin embargo, esta metodología podría ser adaptado para evaluar la incorporación de isótopos en los metabolitos intermediarios en una etapa específica de larvas (por ejemplo, L2) en lugar de esperar a los animales para llegar a la etapa adulta. Del mismo modo, los animales que entran en la etapa larval alternativa conocida como Dauer probablemente han alterado significativamente (probabilidad baja) del metabolismo de flujo en relación con los animales que proceden directamente a través de los cuatro estadios larvarios. Estudio en el futuro también se podría realizar una evaluación directa de la incorporación isotópica en los animales etapa Dauer de diferentes orígenes genéticos. Exponiendo los animales a los isótopos estables por un período de tiempo fijo (en este caso, 24 a 48 horas) a partir una vez que los animales llegaron a la etapa de adulto joven (como se detalla en el Protocolo B) elimina el impacto de la variable de períodos de desarrollo. Mientras que el 13 C-glucosa en el metabolismo de la glucólisis sólo interroga, el piruvato y el flujo del ciclo del ácido tricarboxílico, otros trazadores isotópicos podrían ser evaluados para interrogar flujo vía bioquímica a través de otras vías de interés en los nematodos. Por ejemplo, 15 N-glicina podría ser utilizada para evaluar el volumen de negocios de aminoácidos en los nematodos. Otra limitación potencial de este enfoque es el nivel de sensibilidad de la detección de metabolitos. Nuestra experiencia sugiere un mínimo de 500 nematodos adultos jóvenes son necesarios para cuantificar el éxito constitución isotópica de los métodos HPLC y GC / MS empleado aquí. Utilización de instrumentos con una mayor sensibilidad, como la cromatografía líquida de ultra (UPLC), puede permitir una mayor reducción del número de animales estudiados, aunque prevemos que esto es poco probable que permitan la cuantificación fiable de los metabolitos y la incorporación de isótopos en las especies de gusanos de un solo metabolito. Se estudiaron las poblaciones de gusanos de 1.000 animales por experimento, que nos pareció confiable detectar metabolitos de baja abundancia en cada cepa. Sin embargo, algunos metabolitos, como el GABA, sólo puede cuantificarse en las poblaciones mucho más grandes de los nematodos, en el orden de1x10 6 animales 4. En resumen, los perfiles de isótopos estables proporciona una manera no invasiva y segura (no radiactivo) enfoque que ha sido utilizado para estudiar los errores innatos del metabolismo. Aplicación de esta metodología a C. elegans proporciona la capacidad de la novela para investigar in vivo, en tiempo real, las alteraciones metabólicas que se producen en el nivel animal entero, que puede ser consecuencia de trastornos genéticos individuales y / o exposiciones farmacológicas del agente.

<table><tbody><tr><td>S. basal</td><td></td><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; - página 59</td><td>Protocolos A y B</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8503</td><td>Protocolo B</td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Centro de Genética Caenorhabditis</td><td></td><td>Protocolos A y C</td></tr><tr><td>K12 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Centro de Genética Caenorhabditis</td><td></td><td>Protocolo B</td></tr><tr><td>agar NGM</td><td>Research Products International Corp.</td><td>N81800-1000.0</td><td>Protocolos A, B y C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C glucosa (marcada universalmente)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-1396</td><td>Protocolo A y C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C glucosa (1,6 marcada)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-2717</td><td>Protocolo B</td></tr><tr><td>Ácido perclórico al 60 % (PCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MK2766500</td><td>Protocolos A y B</td></tr><tr><td>&amp;#949;-ácido aminocaproico (estándar interno)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2504</td><td>Protocolos A y B</td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Regis</td><td>270243</td><td>Protocolo E</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Regis</td><td>270010</td><td>Protocolo E</td></tr><tr><td>Resina AG 1-X8, 100-200, forma cloruro</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1441</td><td>Protocolos A y B (extracción de ácidos orgánicos)</td></tr><tr><td>Resina AG 50W-X8, 100-200, en forma de hidrógeno</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1441</td><td>Protocolos A y B (extracción de aminoácidos)</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8875</td><td>Protocolo C</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Protocolo C</td></tr><tr><td>3N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>1N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocolo A</td></tr><tr><td>HCl 0,1 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>4N NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>4N KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Protocolos A y B</td></tr><tr><td>Agua desionizada</td><td>Milli Q Biocel</td><td>ZMQA60F01</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>Helio</td><td>Airgas</td><td>24001364</td><td>Protocolo C2</td></tr><tr><td>Microscopio estéreo de zoom SMZ-800</td><td>Nikon Instruments</td><td>NI MNA41000</td><td>Protocolos A, B y C</td></tr><tr><td>medidor de pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S68167</td><td>Protocolos A y B</td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa - 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-93</td><td>Protocolos A y B</td></tr><tr><td>Agitador orbital con incubación</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1324-0004</td><td>Protocolo B</td></tr><tr><td>Mini rotador LabRoller</td><td>Labnet International</td><td>H-5500</td><td>Protocolos A y B</td></tr><tr><td>Pisones</td><td>Kontes Corp</td><td>K749520-0090</td><td>Protocolos A y B</td></tr><tr><td>Perforar</td><td>Kontes Corp</td><td>K749540-0000</td><td>Protocolos A y B</td></tr><tr><td>vaso de precipitados de vidrio de 1 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-539P</td><td></td></tr><tr><td>Matraces Erlenmeyer de 1 L</td><td>VWR international</td><td>89000-368</td><td></td></tr><tr><td>Matraces Erlenmeyer de 25 mL</td><td>VWR international</td><td>89000-356</td><td>Protocolo B</td></tr><tr><td>Tubos de vidrio redondos de 7 ml + tapón de goma</td><td>VWR international</td><td>VT6431</td><td>Protocolos A, B y C1, C2</td></tr><tr><td>Tubos de vidrio redondos de 10 ml + tapón de goma</td><td>VWR international</td><td>VT6430</td><td>Protocolo C2</td></tr><tr><td>Tubos con tapón azul</td><td>Labco</td><td>438B</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de plástico de 50 ml</td><td>Falcon BD</td><td>14-959-49A</td><td>Todos los protocolos</td></tr><tr><td>tubos microcéntrifugos de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td>Protocolos A y B</td></tr><tr><td>Jeringas (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td><td>BD Biosciences</td><td>301025, 301029, 301031</td><td>Protocolos C1 y C2</td></tr><tr><td>Agujas de calibre 25</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-253-131</td><td>Protocolos C1 y C2</td></tr><tr><td>Columnas cromatográficas Poly-Prep</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur</td><td>VWR international</td><td>14673-043</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>Placas de Petri de 60 mm</td><td>VWR international</td><td>25373-085</td><td>Protocolo C</td></tr><tr><td>Cámara de vidrio (fondo recortado de un matraz de 1 L) equipada con llave de paso de tres vías sellada con grasa</td><td>Personalizado</td><td></td><td>Protocolo C</td></tr><tr><td>Placa de vidrio ópticamente transparente</td><td>Hecho a medida</td><td></td><td>Protocolo C</td></tr><tr><td>Evaporador Reacti-Vap III</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>18826</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>Algodón</td><td>VWR international</td><td>14224-516</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>Grasa de alto vacío</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td>Protocolo C1</td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-18</td><td>Protocolo B</td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-2504-5</td><td>Protocolo C</td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas de relación de gases</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>GC-EM</td><td>Hewlett-Packard</td><td>5980/5971</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>GC-EM</td><td>Agilent Technologies</td><td>6980N/5973N</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>9010</td><td>Protocolo D</td></tr></tbody></table>

perfiles de isótopos estables de flujo intermediarios metabólicos en fase de desarrollo y de adultos caenorhabditis elegans</em

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Perfiles de isótopos estables ha permitido a largo investigaciones sensibles de las consecuencias metabólicas de las mutaciones genéticas y / o tratamientos farmacológicos en modelos celulares y los mamíferos. A continuación, describimos los métodos detallados para realizar perfiles de isótopos estables del metabolismo intermediario y de flujo metabólico en el nematodo Caenorhabditis elegans. Se describen los métodos para crear perfiles de todo gusano aminoácidos libres, el dióxido de carbono marcado, etiquetado ácidos orgánicos y aminoácidos marcados en animales expuestos a cualquiera de los isótopos estables de desarrollo temprano en las placas de agar crecimiento de nematodos o los medios de comunicación a partir de adultos jóvenes por la exposición a diversos tratamientos farmacológicos en cultivo líquido. Los aminoácidos libres son cuantificados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en alícuotas gusano extrae todo en el 4% de ácido perclórico. Universalmente marcado con 13 C-glucosa o 1,6 - 13 C 2-glucosa se ​​utiliza como precursor de isótopos estables de carbono marcado que se traza mediante espectrometría de masas de dióxido de carbono (tanto en la atmósfera y disuelto), así como en los metabolitos de indicativo de flujo a través de la glucólisis , el metabolismo del piruvato y el ciclo del ácido tricarboxílico. Los resultados representativos se incluyen para demostrar los efectos del tiempo de los isótopos de la exposición, varios protocolos de intercambio de bacterias, y otros métodos de interrupción del gusano de tipo salvaje nematodos, así como el grado relativo de incorporación de isótopos en el complejo III mitocondrial gusanos mutantes (ISP-1 (qm150) ) en relación con los gusanos de tipo salvaje. La aplicación de perfiles de isótopos estables en los nematodos de vida ofrece una capacidad nueva para investigar las alteraciones en el animal completo nivel metabólico en tiempo real que son causadas por desórdenes genéticos individuales y / o tratamientos farmacológicos.

Perfiles de isótopos estables de análisis de cromatografía de gases espectrometría de masa de flujo de intermediario metabólico se describe en el nematodo,<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Los métodos son detallados para evaluar el enriquecimiento isotópico en el dióxido de carbono, ácidos orgánicos y aminoácidos después de la exposición, ya sea durante el desarrollo de isótopos en placas de agar o en la edad adulta en cultivo líquido.

Perfiles de isótopos estables de flujo intermediarios metabólicos en fase de desarrollo y de Adultos Caenorhabditis elegans</em

El perfilado isotópico estable ha permitido durante mucho tiempo investigaciones sensibles sobre las consecuencias metabólicas de las mutaciones genéticas y/o las terapias farmacológicas en...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en monitorear de forma no invasiva alteraciones metabólicas en tiempo real a nivel de organismo completo dentro de la glucólisis, el metabolismo del piruvato y el ciclo del ácido tricarboxílico, provocadas por vías metabólicas individuales, alteraciones genéticas y/o tratamientos farmacológicos. Esto se logra suministrando isótopos estables a nematodos vivos para obtener un enriquecimiento isotópico suficiente en un mayor número de metabolitos, lo que permite cuantificar alteraciones genéticas y/o farmacológicas en las vías metabólicas intermedias. Como segundo paso, se mide la incorporación isotópica en el dióxido de carbono atmosférico y disuelto mediante espectrometría de masas de relación de gases, lo que proporciona una evaluación más directa del flujo metabólico intermedio durante períodos cortos de tiempo.A continuación, las muestras se procesan para el análisis de aminoácidos libres en gusanos enteros mediante HPLC, así como mediante enriquecimiento isotópico en aminoácidos y ácidos orgánicos mediante GCMS, con el fin de cuantificar la alteración del flujo metabólico en nematodos. Tras la exposición a isótopos estables, se obtienen resultados que muestran los efectos de duraciones variables de exposición al isótopo, eliminación bacteriana y ruptura alternativa del gusano en gusanos de tipo salvaje, para investigar la abundancia isotópica en metabolitos intermedios. Este método puede proporcionar información sobre la regulación del metabolismo intermedio.También puede aplicarse a nuestros sistemas, como líneas celulares y tejidos de mamíferos. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando observamos anomalías consistentes en el análisis de aminoácidos libres en gusanos mediante HPLC, que sugerían un flujo metabólico intermedio alterado en cambios primarios de la función respiratoria. Para comenzar este procedimiento.Gusanos que han sido expuestos a un precursor metabólico marcado con isótopo estable, ya sea durante el desarrollo o en la edad adulta, se recolectan en un tubo plástico de centrífuga de 1,5 mililitros. Por lo general, diluimos los gusanos hasta una concentración de 1000 gusanos por un mililitro. Añada ácido perclórico al 60 % que contiene ácido epsilon aminocaproico como estándar interno a los gusanos hasta una concentración final de ácido perclórico al 4 % y 20 nanomolar del estándar interno.Deje que el gusano sedimente por gravedad durante cinco minutos, luego retire y guarde el sobrenadante en otro tubo. El siguiente paso es uno de los aspectos más críticos de este procedimiento. Los gusanos deben ser completamente desintegrados mediante tamizado antes del análisis de metabolitos libres. Utilizando un homogenizador de plástico y una taladradora motorizada, muela las muestras de gusanos durante 15 segundos.Confirme visualmente la ruptura de los gusanos mediante microscopía de luz y repita la molienda si es necesario. En esta imagen, los paneles A y B muestran gusanos antes de la molienda. En contraste con los paneles C y D, que muestran gusanos después de la molienda, transfiera el sobrenadante previamente guardado a los tubos plásticos de centrífuga de 1,5 mililitros junto con el homogenato de gusanos y centrifugue.Las muestras a 2.250 RPM, 1300 G durante cinco minutos. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un tubo de vidrio nuevo de siete mililitros. Guarde el sedimento para su uso posterior en un ensayo de concentración de proteínas.Ahora agregue cuatro hidróxido de potasio normal al SUPERNATANTE hasta que el rango de pH de las muestras sea de siete a ocho. Centrifugue las muestras neutralizadas en tubos de vidrio de siete mililitros a 2.250 RPM (1.300 G) durante cinco minutos. Para eliminar las sales, transfiera el sobrenadante de cada muestra a un tubo de vidrio limpio de siete mililitros. Las muestras neutralizadas ya pueden prepararse para la cuantificación de metabolitos mediante cromatografía líquida de alta resolución o HPLC y cromatografía de gases, espectrometría de masas o GCMS para HPLC.Separar 50 microlitros de cada muestra neutralizada para inyección directa en el HPLC. La cuantificación de aminoácidos libres se realiza mediante derivatización previa con aldehído y detección fluorescente. Como se describió anteriormente, las muestras neutralizadas restantes se someterán a extracción utilizando una resina de intercambio iónico para GCMS, con el fin de determinar el enriquecimiento isotópico en aminoácidos y ácidos orgánicos, como se muestra en la siguiente sección.Para preparar las perlas, agregue un ácido clorhídrico normal a perlas G1 y G50 por separado. En vasos de un litro, agite cada frasco durante 30 minutos con un agitador magnético. Después de eso, lave las perlas con agua desionizada 10 veces hasta que el pH de los lavados sea igual al pH del agua.A continuación, mostraremos nuestro método para preparar columnas caseras de bajo costo utilizando pipetas de vidrio. También existen columnas prefabricadas disponibles comercialmente. Para preparar una columna, use pinzas para insertar un tapón de algodón justo por encima de la parte más estrecha de la punta de una pipeta Pasteur, utilice perlas G una para la extracción de ácidos orgánicos y perlas G 50.Para la extracción de aminoácidos, llene cada columna hasta aproximadamente un tercio de la altura de la columna. Si una muestra ya tiene un pH neutro, no se añade nada a la muestra antes de aplicarla a la columna AG uno. Para extraer ácidos orgánicos y extraer aminoácidos, añada un mililitro de ácido clorhídrico 0,1 normal a la muestra antes de aplicarla a la columna AG 50.Ahora aplique las muestras previamente preparadas y neutralizadas a cada columna. Lave cada columna 10 veces con agua hasta que los lavados sean neutros. Una vez completado el lavado, eluya cada columna hacia viales de muestra de vidrio frescos y etiquetados de cuatro mililitros. Para la extracción de ácidos orgánicos, agregue tres mililitros de ácido clorhídrico tres normal a la columna AG uno.Esto permite el análisis del enriquecimiento isotópico en el número total de carbonos marcados entre especies de tres carbonos, especies de cuatro carbonos, especies de cinco carbonos y especies de seis carbonos. Para la extracción de aminoácidos, añada tres mililitros de hidróxido de amonio 4 N a una columna G 50. Esto permite el análisis del enriquecimiento isotópico en el número total de carbonos marcados entre especies de tres carbonos y especies de cinco carbonos.Al finalizar ambas extracciones, la de ácidos orgánicos y la de aminoácidos, coloque los viales de muestra en un evaporador reactivo app three durante la noche hasta que estén secos. Luego, las muestras se derivatizan y analizan mediante GCMS, como se detalla en el texto del Protocolo. Comience este procedimiento transfiriendo mil gusanos adultos jóvenes a una placa experimental de agar NGM de 35 milímetros que contenga glucosa con carbono 13 marcado universalmente y E. coli.A continuación, coloque la placa NGM experimental sin su tapa dentro de una cámara de vidrio personalizada equipada con una llave de paso hermética de tres vías, que permita el muestreo y reemplazo preciso de la atmósfera. Cubra el sello donde el disco de vidrio ópticamente transparente se asienta sobre la placa con grasa de alto vacío.Selle la cámara con el disco de vidrio. Registre el tiempo. A tiempo cero y treinta minutos después, use una jeringa de 20 mililitros para tomar una muestra de 10 mililitros de la atmósfera de la cámara de vidrio mediante la llave de paso de tres vías.Cierre la llave de paso hacia la cámara. Después de tomar la muestra, transfiera la muestra a un tubo de vidrio al vacío de color rojo que contenga un mililitro de bicarbonato de sodio en hidróxido de sodio 0,1 molar. A continuación, inyecte 10 mililitros de aire en la cámara de vidrio a través de la llave de paso de tres vías. Utilizando una jeringa de 20 mililitros, cierre la llave de paso hacia la cámara después de reinyectar la atmósfera y, antes de reanudar la incubación, repita el muestreo de la atmósfera de la cámara de vidrio a los 60, 90 y 120 minutos.Analice estas muestras de dióxido de carbono atmosférico para detectar enriquecimiento de carbono marcado utilizando un espectrómetro de masas de relación de gases según se describe en el texto del Protocolo. Los isótopos estables se incorporan adecuadamente después de dos horas en gusanos adultos jóvenes, como lo demuestra aquí el carbono marcado medido en el dióxido de carbono atmosférico y en el dióxido de carbono disuelto en gusanos, ya sea que se les haya alimentado con OP50 E. coli vivo o muerto por irradiación UV. La relación de dióxido de carbono carbono-13 a dióxido de carbono carbono-12 fue mayor en la fracción de dióxido de carbono disuelto en los gusanos en comparación con el dióxido de carbono atmosférico liberado. Se observó que la exposición prolongada a un isótopo estable desde el período larval y posteriormente el aclaramiento de los gusanos en medio NGM sin bacterias aumentó el enriquecimiento isotópico del glutamato libre en gusanos adultos jóvenes.En este gráfico, L1 representa gusanos alimentados con glucosa marcada universalmente con carbono 13 y bacterias OP50 desde la etapa larval L1 hasta la etapa de adulto joven de 959 células; YA representa gusanos alimentados con glucosa con carbono 13 y bacterias OP50 durante 48 horas, comenzando cuando alcanzaron el primer día de puesta de huevos en la etapa de adulto joven. El eje X indica el número total de átomos de carbono marcados en cada especie de glutamato, y el eje Y indica el porcentaje de enriquecimiento. Todos los animales fueron desprovistos del exceso de marcaje isotópico antes de la preparación posterior de las muestras.Para los análisis de GCMS, las barras verdes indican gusanos despejados tras la exposición isotópica mediante alimentación con E. coli OP50 en placas de NGM durante dos horas antes de la extracción con PCA. Las barras azules y grises indican gusanos despejados tras la exposición isotópica en placas de NGM sin bacterias durante dos o seis horas, respectivamente, antes de la extracción con PCA, independientemente del curso temporal de la exposición isotópica. No se observó ninguna diferencia significativa en el enriquecimiento isotópico de los metabolitos intermedios cuando los animales fueron despejados en placas durante dos o seis horas.En ambos cursos de exposición isotópica, se observó una menor enriquecimiento isotópico en los metabolitos intermedios cuando los animales fueron despejados mediante alimentación con bacterias no marcadas durante dos horas. Por lo tanto, se determinó que el protocolo óptimo de aclaramiento para gusanos cultivados en placas NGM con bacterias esparcidas y isótopos consiste en realizar un aclaramiento durante dos horas en placas NGM sin bacterias, con el fin de optimizar el porcentaje de enriquecimiento en los metabolitos intermedios. Posterior al tratamiento durante 24 horas en cultivo líquido con una glucosa marcada con carbono 13 de seis carbonos sin bacterias.Se realizó una comparación de muestras de gusanos disruptadas por sonicación sola o por sonicación más molienda, como se muestra en esta figura. Los gusanos disruptados por sonicación más molienda presentaron un mayor enriquecimiento isotópico que las muestras disruptadas únicamente por sonicación. Finalmente, se alimentaron gusanos vivos con un precursor isotópico estable, ya sea durante el desarrollo a partir de la etapa L1 en placas o a partir del primer día de puesta de huevos como adultos jóvenes, durante 24 horas en cultivo líquido. Esto permite un análisis sensible del enriquecimiento isotópico entre los metabolitos indicativos del flujo a través de la glucólisis y del metabolismo del piruvato en el ciclo del ácido tricarboxílico tras su desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que la investigación de enfermedades mitocondriales explore el flujo metabólico intermedio en *C. elegans*. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar el perfilado isotópico estable del metabolismo intermediario y del flujo metabólico en los nematodos, *C. elegans*.

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Investigación

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Aquí detallamos protocolos específicamente diseñados para monitorear los defectos morfogénicos que ocurren durante las fases tempranas y tardías de la elongación embrionaria del nematodo Caenorhabditis elegans. En última instancia, estos protocolos están diseñados para identificar los genes que regulan estas fases y caracterizar sus requisitos diferenciales a lo largo del eje antero-posterior del embrión.

Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

El enfoque del marcador trófica ácidos grasos, es decir, la asimilación de ácidos grasos como toda molécula y transferencia en tejido consumidor leves o no modificación, se ve obstaculizada por las brechas de conocimiento en el metabolismo de ácidos grasos de invertebrados de suelo pequeño. Isotopologue perfilado se presenta como una valiosa herramienta para desentrañar las interacciones tróficas.

Perfiles de ácidos grasos 13C Isotopologue proporciona una idea de la transferencia trófica de carbono y metabolismo de los lípidos de los consumidores invertebrados

Describimos una extracción en pequeña escala modificada y análisis colorimétricos de lactato y piruvato en el nematodo elegans C.. Cuando se utilizan kits de ensayo comerciales, el desarrollo técnico de su sensibilidad y su precisión es importante. Precipitación de proteínas en la extracción es el paso más crítico para la determinación cuantitativa de los metabolitos intracelulares.

Análisis colorimétrico de lactato intracelular en pequeña escala y del piruvato en el nematodo Caenorhabditis elegans

Este protocolo describe un método para el cultivo a gran escala de Caenorhabditis elegans en medios sólidos. Como alternativa a la cultura líquida, este protocolo permite la obtención de parámetros de diferentes escalas basadas en la placa de cultivo. Esto incrementa la comparabilidad de los resultados, omitiendo las diferencias morfológicas y metabólicas entre la cultura de los medios líquidos y sólidos.

Base de placa de cultivo a gran escala de elegans de Caenorhabditis: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes

La respiración mitocondrial es crítica para la supervivencia; por lo tanto, la tasa de consumo de oxígeno es un excelente indicador de la salud mitocondrial. En este protocolo, describimos el uso de un respirómetro comercialmente disponible a medida basal y las tasas de consumo de oxígeno máximo en vivo, intacto y libremente móviles elegans de Caenorhabditis.

Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans

Este estudio presenta protocolos para dos enfoques semiautomatizado de análisis de actividad locomotora en gusanos gas-1(fc21)de la enfermedad de C. elegans complejo I, a saber, ZebraLab (un ensayo de rendimiento medio) y WormScan (un ensayo de alto rendimiento) y proporcionan un análisis comparativo entre una amplia gama de métodos de investigación para cuantificar el comportamiento de los nematodos y la función neuromuscular integrada.

Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans es un modelo poderoso para examinar los determinantes moleculares que impulsan las interacciones entre el huésped y el microbioma. Presentamos una línea de alto rendimiento que perfila los niveles de colonización del microbioma intestinal de un solo animal junto con aspectos clave de la fisiología de C. elegans.

Aplicación de la vermimetría de flujo para la cuantificación y el análisis del microbioma intestinal de Caenorhabditis elegans

Este protocolo describe un ensayo para cuantificar la tasa de alimentación de Caenorhabditis elegans basado en la medición del aclaramiento de bacterias en cultivo líquido.

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Aprende a realizar perfiles de isótopos estables en Caenorhabditis elegans para analizar flujo metabólico en glicólisis y ciclo de Krebs. Este método permite cuantificar alteraciones genéticas y farmacológicas en nematodos.

Perfiles de isótopos estables de flujo intermediarios metabólicos en fase de desarrollo y de Adultos Caenorhabditis elegans

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