Perfiles de isótopos estables de flujo intermediarios metabólicos en fase de desarrollo y de Adultos Caenorhabditis elegans

El objetivo general del siguiente experimento consiste en monitorear de forma no invasiva alteraciones metabólicas en tiempo real a nivel de organismo completo dentro de la glucólisis, el metabolismo del piruvato y el ciclo del ácido tricarboxílico, provocadas por vías metabólicas individuales, alteraciones genéticas y/o tratamientos farmacológicos. Esto se logra suministrando isótopos estables a nematodos vivos para obtener un enriquecimiento isotópico suficiente en un mayor número de metabolitos, lo que permite cuantificar alteraciones genéticas y/o farmacológicas en las vías metabólicas intermedias. Como segundo paso, se mide la incorporación isotópica en el dióxido de carbono atmosférico y disuelto mediante espectrometría de masas de relación de gases, lo que proporciona una evaluación más directa del flujo metabólico intermedio durante períodos cortos de tiempo.

A continuación, las muestras se procesan para el análisis de aminoácidos libres en gusanos enteros mediante HPLC, así como mediante enriquecimiento isotópico en aminoácidos y ácidos orgánicos mediante GCMS, con el fin de cuantificar la alteración del flujo metabólico en nematodos. Tras la exposición a isótopos estables, se obtienen resultados que muestran los efectos de duraciones variables de exposición al isótopo, eliminación bacteriana y ruptura alternativa del gusano en gusanos de tipo salvaje, para investigar la abundancia isotópica en metabolitos intermedios. Este método puede proporcionar información sobre la regulación del metabolismo intermedio.

También puede aplicarse a nuestros sistemas, como líneas celulares y tejidos de mamíferos. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando observamos anomalías consistentes en el análisis de aminoácidos libres en gusanos mediante HPLC, que sugerían un flujo metabólico intermedio alterado en cambios respiratorios primarios de la función. Para comenzar este procedimiento.

Gusanos que han sido expuestos a un precursor metabólico marcado con isótopo estable durante el desarrollo o en la edad adulta se recogen en un tubo plástico de centrífuga de 1,5 mililitros. Por lo general, diluimos los gusanos hasta una concentración de 1000 gusanos por un mililitro. Añada ácido perclórico al 60 % que contiene ácido epsilon aminocaproico como estándar interno a los gusanos hasta una concentración final de ácido perclórico al 4 % y 20 nanomolar del estándar interno.

Deje que el gusano sedimente por gravedad durante cinco minutos, luego retire y guarde el sobrenadante en otro tubo. El siguiente paso es uno de los aspectos más críticos de este procedimiento. Los gusanos deben ser completamente desintegrados mediante tamizado antes del análisis de metabolitos libres. Utilizando un homogenizador de plástico y un taladro motorizado, muela las muestras de gusanos durante 15 segundos.

Confirme visualmente la ruptura de los gusanos mediante microscopía de luz y repita la molienda si es necesario. En esta imagen, los paneles A y B muestran gusanos antes de la molienda. En contraste con los paneles C y D, que muestran gusanos después de la molienda, transfiera el sobrenadante previamente guardado a los tubos plásticos de centrífuga de 1,5 mililitros junto con el homogenato de gusanos y centrifugue.

Las muestras a 2.250 RPM, 1300 G durante cinco minutos. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un tubo de vidrio nuevo de siete mililitros. Guarde el sedimento para su uso posterior en un ensayo de concentración de proteínas.

Ahora agregue cuatro hidróxido de potasio normal al SUPERNATANTE hasta que el rango de pH de las muestras sea de siete a ocho. Centrifugue las muestras neutralizadas en tubos de vidrio de siete mililitros a 2.250 RPM (1.300 G) durante cinco minutos. Para eliminar las sales, transfiera el sobrenadante de cada muestra a un tubo de vidrio limpio de siete mililitros. Las muestras neutralizadas ya pueden prepararse para la cuantificación de metabolitos mediante cromatografía líquida de alta resolución o HPLC y cromatografía de gases, espectrometría de masas o GCMS para HPLC.

Separar 50 microlitros de cada muestra neutralizada para inyección directa en el HPLC. La cuantificación de aminoácidos libres se realiza mediante derivatización previa con aldehído y detección fluorescente. Como se describió anteriormente, las muestras neutralizadas restantes se someterán a extracción utilizando una resina de intercambio iónico para GCMS, con el fin de determinar el enriquecimiento isotópico en aminoácidos y ácidos orgánicos, como se muestra en la siguiente sección.

Para preparar las perlas, agregue un ácido clorhídrico normal a perlas G1 y G50 por separado. En vasos de un litro, agite cada frasco durante 30 minutos con un agitador magnético. Después de eso, lave las perlas con agua desionizada 10 veces hasta que el pH de los lavados sea igual al pH del agua.

A continuación, mostraremos nuestro método para preparar columnas caseras de bajo costo utilizando pipetas de vidrio. También existen columnas prefabricadas disponibles comercialmente. Para preparar una columna, use pinzas para insertar un tapón de algodón justo por encima de la parte más estrecha de la punta de una pipeta Pasteur, utilice perlas G una para la extracción de ácidos orgánicos y perlas G 50.

Para la extracción de aminoácidos, llene cada columna hasta aproximadamente un tercio de la altura de la columna. Si una muestra ya tiene un pH neutro, no se añade nada a la muestra antes de aplicarla a la columna AG uno. Para extraer ácidos orgánicos y extraer aminoácidos, añada un mililitro de ácido clorhídrico 0,1 normal a la muestra antes de aplicarla a la columna AG 50.

Ahora aplique las muestras previamente preparadas y neutralizadas a cada columna. Lave cada columna 10 veces con agua hasta que los lavados sean neutros. Una vez completado el lavado, eluya cada columna hacia viales de muestra de vidrio frescos y etiquetados de cuatro mililitros. Para la extracción de ácidos orgánicos, agregue tres mililitros de ácido clorhídrico tres normal a la columna AG una.

Esto permite el análisis del enriquecimiento isotópico en el número total de carbonos marcados entre especies de tres carbonos, especies de cuatro carbonos, especies de cinco carbonos y especies de seis carbonos. Para la extracción de aminoácidos, añada tres mililitros de hidróxido de amonio 4 N a una columna G 50. Esto permite el análisis del enriquecimiento isotópico en el número total de carbonos marcados entre especies de tres carbonos y especies de cinco carbonos.

Al finalizar ambas extracciones, la de ácidos orgánicos y la de aminoácidos, coloque los viales de muestra en un evaporador reactivo con tres posiciones durante la noche hasta que estén secos. Luego, las muestras se derivatizan y se analizan mediante GC-EM según se detalla en el texto del protocolo. Comience este procedimiento transfiriendo mil gusanos adultos jóvenes a una placa experimental de agar NGM de 35 milímetros que contenga glucosa con carbono 13 universalmente marcado y E. coli.

A continuación, coloque la placa NGM experimental sin su tapa dentro de una cámara de vidrio personalizada equipada con una llave de paso hermética de tres vías, que permita el muestreo y reemplazo preciso de la atmósfera. Cubra el sello donde el disco de vidrio ópticamente transparente se asienta sobre la placa con grasa de alto vacío.

Cierre la cámara con el disco de vidrio. Registre el tiempo. Transcurridos 30 minutos desde el tiempo cero, use una jeringa de 20 mililitros para extraer 10 mililitros de la atmósfera de la cámara de vidrio mediante la llave de paso de tres vías.

Cierre la llave de paso hacia la cámara. Después de tomar la muestra, transfiera la muestra a un tubo de vidrio al vacío de color rojo que contenga un mililitro de bicarbonato de sodio en hidróxido de sodio 0,1 molar. A continuación, inyecte 10 mililitros de aire en la cámara de vidrio a través de la llave de paso de tres vías. Utilizando una jeringa de 20 mililitros, cierre la llave de paso hacia la cámara después de reinyectar la atmósfera y, antes de reanudar la incubación, repita el muestreo de la atmósfera de la cámara de vidrio a los 60, 90 y 120 minutos.

Analice estas muestras de dióxido de carbono atmosférico para detectar el enriquecimiento de carbono marcado utilizando un espectrómetro de masas de relación de gases según se describe en el texto del Protocolo. Los isótopos estables se incorporan adecuadamente después de dos horas en gusanos adultos jóvenes, como se evidencia aquí por el carbono marcado medido en el dióxido de carbono atmosférico y en el dióxido de carbono disuelto en gusanos, ya sea alimentados con OP50 E. coli vivo o inactivado por irradiación UV. La relación de dióxido de carbono con carbono-13 a dióxido de carbono con carbono-12 fue mayor en la fracción de dióxido de carbono disuelto en los gusanos en comparación con el dióxido de carbono atmosférico liberado. Se observó que la exposición prolongada a un isótopo estable desde el período larval, seguida del aclaramiento de los gusanos en medio NGM sin bacterias, aumentó el enriquecimiento isotópico del glutamato libre en gusanos adultos jóvenes.

En este gráfico, L1 representa gusanos alimentados con glucosa marcada universalmente con carbono 13 y bacterias OP50 desde la etapa larval L1 hasta la etapa de adulto joven con 959 células; YA representa gusanos alimentados con glucosa con carbono 13 y bacterias OP50 durante 48 horas, comenzando cuando alcanzaron el primer día de puesta de huevos en la etapa de adulto joven. El eje X indica el número total de átomos de carbono marcados en cada especie de glutamato, y el eje Y indica el porcentaje de enriquecimiento. Todos los animales fueron desprovistos del exceso de marcaje isotópico antes de la preparación de muestras para análisis posteriores.

Para los análisis por GCMS, las barras verdes indican gusanos descontaminados tras la exposición isotópica mediante alimentación con E. coli OP50 en placas de NGM durante dos horas antes de la extracción con PCA. Las barras azules y grises indican gusanos descontaminados tras la exposición isotópica en placas de NGM sin bacterias durante dos o seis horas, respectivamente, antes de la extracción con PCA, independientemente del curso temporal de la exposición isotópica. No se observó ninguna diferencia significativa en el enriquecimiento isotópico de los metabolitos intermedios cuando los animales fueron descontaminados en placas durante dos o seis horas.

En ambos cursos de exposición isotópica, se observó menos enriquecimiento isotópico en los metabolitos intermedios cuando los animales fueron despejados mediante la alimentación con bacterias no marcadas durante dos horas. Por lo tanto, se determinó que el protocolo de despeje óptimo para gusanos cultivados en placas NGM con bacterias extendidas y isótopo consiste en realizar un despeje durante dos horas en placas NGM sin bacterias extendidas, con el fin de optimizar el porcentaje de enriquecimiento en los metabolitos intermedios. Tras el tratamiento durante 24 horas en cultivo líquido con una glucosa con seis carbonos 13 sin bacterias.

Se realizó una comparación de muestras de gusanos disruptadas por sonicación sola o por sonicación más molienda, como se muestra en esta figura. Los gusanos disruptados por sonicación más molienda presentaron un mayor enriquecimiento isotópico que las muestras disruptadas únicamente por sonicación. Finalmente, se alimentaron gusanos vivos con un precursor isotópico estable, ya sea durante el desarrollo a partir de la etapa L1 en placas o a partir del primer día de puesta de huevos como adultos jóvenes, durante 24 horas en cultivo líquido. Esto permite un análisis sensible del enriquecimiento isotópico entre los metabolitos indicativos del flujo a través de la glucólisis y del metabolismo del piruvato en el ciclo del ácido tricarboxílico tras su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para investigar enfermedades mitocondriales y explorar el flujo metabólico intermedio en Caenorhabditis elegans. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar el perfilado isotópico estable del metabolismo intermediario y del flujo metabólico en los nematodos, C. elegans.