Perfiles de isótopos estables de flujo intermediarios metabólicos en fase de desarrollo y de Adultos Caenorhabditis elegans

El objetivo general del siguiente experimento es monitorear de manera no invasiva las alteraciones metabólicas en tiempo real a nivel de todo el animal dentro de la glucólisis, el metabolismo del piruvato y el ciclo del ácido tricarboxílico que son causadas por vías metabólicas individuales, alteraciones genéticas y/o tratamientos farmacológicos. Esto se logra alimentando con isótopos estables a los nematodos vivos para proporcionar un enriquecimiento isotópico suficiente en más metabolitos para permitir la cuantificación de alteraciones genéticas y/o farmacológicas en las vías metabólicas intermedias. Como segundo paso, la incorporación isotópica en el dióxido de carbono atmosférico y disuelto se mide mediante espectrometría de masas de relación de gases, que proporciona una evaluación más directa del flujo metabólico intermedio en períodos cortos de tiempo.

Las siguientes muestras se procesan para el análisis de aminoácidos libres de gusanos enteros mediante HPLC, así como para el enriquecimiento isotópico en aminoácidos y ácidos orgánicos mediante GCMS con el fin de cuantificar la alteración del flujo metabólico en los nematodos. Después de la exposición a isótopos estables, se obtienen resultados que muestran los efectos de las duraciones variables de la exposición a los isótopos, la eliminación bacteriana y la disrupción alternativa de gusanos en gusanos de tipo salvaje para interrogar la abundancia isotópica en metabolitos intermediarios. La guerra con el método puede proporcionar información sobre la vela contra el metabolismo intermediario.

También se puede aplicar a nuestros sistemas, como las líneas celulares y los tejidos de mamíferos. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando observamos anomalías consistentes en el análisis de aminoácidos de gusano libre por HPLC que sugerían un deterioro del flujo metabólico intermediario en la función de cambios respiratorios primarios. Para iniciar este procedimiento.

Los gusanos que han estado expuestos a un precursor metabólico marcado con isótopos estables, ya sea durante el desarrollo o en la edad adulta, se recogen en un tubo de centrífuga de plástico de 1,5 mililitros. Por lo general, diluimos los gusanos a una concentración de 1000 gusanos por mililitro. Añadir a las lombrices un 60% por ácido clorhídrico que contenga ácido épsilon aminocaproico como patrón interno hasta una concentración final de 4% por ácido clórico y 20 nanomolares de patrón interno.

Deje que el lombriz se asiente por gravedad durante cinco minutos, luego retire y guarde el sobrenadante en otro tubo. El siguiente paso es uno de los aspectos más críticos de este procedimiento. Los gusanos deben ser completamente destruidos por el cribado antes del análisis de metabolitos libres Utilizando un homogeneizador de plástico y un taladro motorizado, muela las muestras de gusanos durante 15 segundos.

Confirme visualmente la interrupción del gusano mediante microscopía óptica y repita la molienda si es necesario. En esta imagen, los paneles A y B muestran gusanos antes de la molienda. A diferencia de los paneles C y D, que muestran gusanos después de la molienda, transfiera el sobrenadante previamente guardado a los tubos de centrífuga de plástico de 1,5 mililitros con la centrífuga Homogeneate de gusanos.

Las muestras a 2, 250 RPM 1300 Gs durante cinco minutos. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un tubo de vidrio nuevo de siete mililitros. Guarde el gránulo para su uso posterior en un ensayo de concentración de proteínas.

Ahora agregue cuatro hidróxidos de potasio normales al SUPERNAT hasta que el rango de pH de las muestras sea de siete a ocho centrífugas. Las muestras neutralizadas en los tubos de vidrio de siete mililitros a 2, 250 RPM 1300 Gs durante cinco minutos Para eliminar las sales, transfiera el sobrenadante de cada muestra a un tubo de vidrio fresco de siete mililitros. Las muestras neutralizadas ahora se pueden preparar para la cuantificación de metabolitos mediante cromatografía líquida de alta resolución o HPLC y cromatografía de gases, espectrometría de masas o GCMS para HPLC.

Separe 50 microlitros de cada muestra neutralizada para inyectarla directamente en la HPLC. La cuantificación de aminoácidos libres se realiza mediante derivación precal con aldehído de al y detección fluorescente. Como se describió anteriormente, las muestras neutralizadas restantes se someterán a una extracción utilizando una resina de intercambio iónico para GCMS para determinar el enriquecimiento isotópico en aminoácidos y ácidos orgánicos, como se muestra en la siguiente sección.

Para preparar las cuentas, agregue un ácido clorhídrico normal a una G uno y una G 50 cuentas por separado. En vasos de precipitados de un litro, revuelva cada matraz durante 30 minutos con un revuelto magnético. Después de eso, lave las perlas con agua desionizada 10 veces hasta que el pH de los lavados sea igual al pH del agua.

A continuación, mostraremos nuestro método para preparar columnas de bajo costo hechas a medida utilizando pipetas de vidrio. Las columnas prefabricadas también están disponibles comercialmente. Para preparar una columna, use pinzas para insertar un tapón de algodón justo por encima de la parte más estrecha de la punta de una pipeta de pasto, use una cuenta G one para la extracción de ácido orgánico y una cuenta G 50.

Para la extracción de aminoácidos, llene cada columna hasta aproximadamente un tercio de la altura de la columna. Si una muestra ya está a pH neutro, no se añade nada a la muestra antes de aplicarla a la columna AG one. Para extraer ácidos orgánicos y extraer aminoácidos, agregue un mililitro de ácido clorhídrico normal 0,1 a la muestra antes de aplicarla a la columna AG 50.

Ahora aplique las muestras neutralizadas previamente preparadas a cada columna. Lave cada columna 10 veces con agua hasta que los lavados sean neutros. Una vez finalizado el lavado, eluya cada columna en viales de muestra de vidrio de cuatro mililitros recién etiquetados Para la extracción de ácidos orgánicos, agregue tres mililitros de ácido clorhídrico normal a la columna AG uno.

Esto permite analizar el enriquecimiento de isótopos en el número total de carbonos marcados entre tres especies de carbono, cuatro especies de carbono, cinco especies de carbono y seis especies de carbono. Para la extracción de aminoácidos, agregue tres mililitros de cuatro hidróxido de amonio normal a la columna a G 50. Esto permite analizar el enriquecimiento de isótopos en el número total de carbonos marcados entre tres especies de carbono y cinco especies de carbono.

Una vez finalizadas las extracciones de ácidos orgánicos y aminoácidos, coloque los viales de muestra en un evaporador reactivo de tres aplicaciones durante la noche hasta que estén secos. A continuación, las muestras se seleccionan y analizan mediante GCMS como se detalla en el texto del protocolo. Comience este procedimiento transfiriendo mil gusanos adultos jóvenes a una placa experimental de NGM de 35 milímetros que contiene carbono 13 glucosa y E. coli marcados universalmente.

A continuación, coloque la placa NGM experimental sin su cubierta. En una cámara de vidrio personalizada equipada con una llave de paso de tres vías bien sellada para permitir un muestreo y reemplazo precisos de la atmósfera. Cubra el sello donde se asienta el disco de vidrio ópticamente transparente en la placa con grasa de alto vacío.

Selle la cámara con el disco de vidrio y registre la hora. Como tiempo cero, 30 minutos más tarde, use una jeringa de 20 mililitros para muestrear 10 mililitros de la atmósfera de la cámara de vidrio junto a la llave de parada de tres vías.

Cierre la llave de paso a la cámara Después de la toma de muestras, transfiera la muestra a un tubo de vidrio aspirado en tina roja que contenga un mililitro de bicarbonato de sodio en hidróxido de sodio 0,1 molar. A continuación, inyecte 10 mililitros de aire en la cámara de vidrio a través de la llave de paso de tres vías. Con una jeringa de 20 mililitros, cierre la llave de parada a la cámara: Después de volver a inyectar la atmósfera y antes de reanudar la incubación, repita la toma de muestras de la atmósfera de la cámara de vidrio a los 60, 90 y 120 minutos.

Analice estas muestras de dióxido de carbono atmosférico para el enriquecimiento de carbono marcado utilizando un espectrómetro de masas de relación de gases como se describe en el texto del Protocolo, los isótopos estables se incorporan bien después de dos horas en gusanos adultos jóvenes, como lo demuestra aquí el carbono marcado medido en dióxido de carbono atmosférico y el dióxido de carbono de lombriz disuelto en gusanos alimentados con OP 50 e coli muertos vivos o irradiados con rayos UV. La relación entre el dióxido de carbono 13 y el dióxido de carbono 12 fue mayor en la fracción de dióxido de carbono de gusano disuelto en relación con el dióxido de carbono atmosférico liberado. Se observó que la exposición prolongada a un isótopo estable del período larvario y la posterior eliminación de gusanos en NGM Aate sin bacterias aumentaron el enriquecimiento isotópico de glutamato libre en gusanos adultos jóvenes.

En este gráfico, L one representa gusanos alimentados con glucosa de carbono 13 y bacterias OP 50 marcados universalmente desde la etapa larvaria L one hasta la etapa de adulto joven de 959 células, YA representa gusanos alimentados con glucosa de carbono 13 y bacterias OP 50 durante 48 horas a partir de que alcanzaron el primer día de la etapa de adulto joven de puesta de huevos. El eje x indica el número total de átomos de carbono marcados en cada especie de glutamato, y el eje Y indica el porcentaje de enriquecimiento. Todos los animales fueron eliminados del exceso de etiquetas isotópicas antes de la preparación de la muestra aguas abajo.

Para los análisis de GCMS, las barras verdes indican que los gusanos se han eliminado después de la exposición isotópica mediante la alimentación con OP 50 E. coli en placas NGM durante dos horas antes de la extracción de PCA. Las barras azules y grises indican que los gusanos se han eliminado después de la exposición isotópica en placas NGM sin bacterias durante dos o seis horas, respectivamente, antes de la extracción de PCA, independientemente del curso del tiempo de exposición isotópica. No se observaron diferencias significativas en el enriquecimiento isotópico de metabolitos intermediarios cuando los animales se aclararon en placas durante dos o seis horas.

En ambos ciclos de exposición isotópica, se observó un menor enriquecimiento isotópico en los metabolitos intermedios cuando los animales fueron eliminados alimentándolos con bacterias no marcadas durante dos horas. Por lo tanto, se determinó que el protocolo de limpieza óptimo para los gusanos cultivados en placas de N GM con dispersión bacteriana con isótopos era la limpieza durante dos horas en placas de NGM no diseminadas para optimizar el porcentaje de enriquecimiento en metabolitos intermedios. Después del tratamiento durante 24 horas en cultivo líquido con una glucosa de seis carbonos 13 sin bacterias.

Se realizó una comparación de muestras de gusanos interrumpidas por sonicación sola o sonicación más molienda, como se muestra en esta figura. Los gusanos alterados por la sonicación más la molienda tuvieron un mayor enriquecimiento isotópico que las muestras interrumpidas solo por la sonicación, alimentando finalmente a los gusanos vivos con un precursor isotópico estable, ya sea durante el desarrollo desde la primera etapa L en placas o comenzando el primer día del huevo, poniendo como adultos jóvenes durante 24 horas en cultivo líquido. Permitir un análisis sensible del enriquecimiento isotópico entre los metabolitos indicativos de flujo a través de la glucólisis, el metabolismo del piruvato en el ciclo del ácido tricarboxílico después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para la enfermedad mitocondrial, investigaciones para explorar el flujo metabólico intermedio en la elegancia marina. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar isotópicos estables, perfiles del metabolismo intermediario y flujo metabólico en los nematodos, La elegancia.