Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

Soy Lindsay Garver y soy estudiante de doctorado en el laboratorio del Dr. George Dimopoulos en la Escuela de Salud Pública Johns Hopkins. Y les voy a mostrar cómo hacer el silenciamiento de genes mediado por ARNi utilizando una técnica de inyección. Así que el primer paso es recolectar los mosquitos que vamos a inyectar.

Estos son solo stock y terriblemente Gabi. Es una mezcla de machos y hembras. Y este es nuestro aspirador alimentado por batería.

Tiene un ventilador en su interior, que creará succión, atrayendo a los mosquitos a través de esta boquilla hacia este depósito. Así que nos desconectamos. Tenemos una pequeña puerta de acceso, que normalmente está pegada con cinta adhesiva para mantener a los mosquitos dentro, pero la abrimos e introducimos la boquilla, la encendemos y la usamos para recoger.

Una vez que tenemos los mosquitos dentro, tapamos la parte superior de la boquilla, vemos los mosquitos allí en el depósito. Entonces queremos anestesiar a estos mosquitos. Así que enterramos este embalse en una cubitera que cubrimos con hielo y esperamos a que bajen los mosquitos.

Bien, el siguiente paso es inyectar los mosquitos y para usar eso, usaremos este, que es un nano jet dos. Consiste en una parte de varita, que sostendré. Y esto contendrá la aguja, que dispensará el líquido al mosquito.

El panel de control, que tiene nuestros botones de llenado y vaciado y es responsable de introducir y sacar líquido de la aguja. Y luego este es el pie. Esto se pondrá en el suelo.

Y al empujar esto con el pie se dispensará una gota del volumen adecuado en el mosquito. Entonces, mientras los mosquitos están en el hielo, preparamos la estación de trabajo ajustando un bloque frío a cero grados a dos grados centígrados. Este bloque frío tiene un accesorio plano, que luego tiene una corredera de vidrio montada en él.

Y esto evitará que los mosquitos se muevan mientras intentamos manipularlos. También llevaré una de estas agujas capilares de vidrio. Se trata de un tubo capilar de vidrio normal que se ha calentado y se ha tirado del centro para crear una aguja.

Y esto es lo que contendrá nuestro líquido. Y luego esto es lo que usaremos para inyectar el mosquito y dispensar el líquido. Así que lo siguiente que tenemos que hacer es colocar la aguja capilar en nuestra varilla inyectora.

Retiramos la pieza de la nariz. Asegúrese de que los anillos interiores estén colocados de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Desliza la aguja de vidrio hacia abajo en la pieza de la nariz, teniendo cuidado con la punta para no romperla.

Una vez que esté seguro, deslice la aguja de la varita en la aguja capilar y enrosque firmemente la pieza nasal. Lo siguiente es asegurarse de que la aguja de su tubo capilar tenga un buen ancho para las inyecciones. Este es un punto realmente importante porque una aguja demasiado delgada no dispensará la cantidad correcta de líquido y una punta de aguja demasiado gruesa dañará al mosquito y posiblemente causará la muerte.

Esto es algo que requiere mucha práctica, pero un buen ancho es realmente crucial para la inyección adecuada y la supervivencia de sus mosquitos. Lo que hago es usar sus pinzas de punta fina para romper la punta de la aguja de modo que la aguja aún esté flexible pero estable. Necesitamos nuestra muestra de ARN bicatenario.

Esta muestra se preparó utilizando un kit. Hay una variedad de kits en el mercado que pueden generar ARN de doble estándar específicos para el gen de interés. Usamos nuestros ARN a una concentración de tres microgramos por microlitro, y tenemos nuestro conjunto de nano inyección para que una inyección dispense 69 nanolitros en posición.

El tubo coloca nuestra aguja en el líquido y usa el botón de llenado en la expulsión n para aspirar líquido hacia la aguja. La cantidad de líquido que necesitará en la aguja es directamente proporcional a la cantidad de mosquitos que inyectará. ¿Bien? Y ahora tenemos que preparar a los mosquitos.

Así que cogemos nuestro plato de plástico P dos y lo incrustamos en nuestro cubo de hielo. Comprobamos que nuestros mosquitos no se mueven y los esparcimos finamente sobre la fría placa de Petri. Esto asegura que mientras trabajamos, los mosquitos no se muevan y no estén volando.

A continuación, colocamos los mosquitos en nuestro portaobjetos de cristal, que ahora está a cero grados centígrados. Y la posición de los mosquitos es crucial para la forma en que los inyectamos. Por lo tanto, desea que sus mosquitos estén alineados ordenadamente para que sepa cuáles se han inyectado y cuáles no.

Y también desea que haya suficiente espacio entre sus mosquitos para que pueda alcanzarlos con el inyector. Así que transferimos mosquitos individuales del plato de peewee al tobogán, cuidando, cuidando de manipularlos por las patas. Esto evita aplastar los cuerpos y da como resultado una mayor supervivencia.

Así que ahora estamos listos para inyectar. Usamos las pinzas de punta fina para sostener el mosquito en un lado, yo soy diestro, así que uso esto en mi mano izquierda. Y luego inyectamos desde el otro lado insertando la punta de la aguja en el costado del tórax, de modo que el tórax del mosquito queda intercalado entre las puntas de las pinzas y la punta de la aguja y la punta de la aguja entra.

Una vez que la punta de la aguja esté dentro del tórax, presione el pedal, escuchará un pitido y se dispensará líquido en el tórax del mosquito. Luego pasas al siguiente y repites. De vez en cuando, cuando retire la aguja, verá una gota de líquido que ha salido del sitio de entrada.

Y si esto sucede, puede esperar a que el líquido se reabsorba en el sitio de entrada. Si eso sucede, está bien. Si la gota no se reabsorbe, si la gota se queda en la parte exterior del tórax, entonces ese mosquito debe desecharse y tú, inyectas otro en su lugar.

También es importante asegurarse de que la aguja solo penetre en el tórax hasta donde sea necesario. No querrás empujar hacia el otro lado o permitir que pase demasiado ancho de aguja. La supervivencia del tórax o del mosquito se verá comprometida.

Así que continuamos ese procedimiento para todos los mosquitos según sea necesario. Entonces, para almacenar sus mosquitos inyectados, usamos un vaso forrado de cera de cartón de una pinta que se ha cubierto con una red de malla delgada y se ha asegurado con una banda elástica y una tapa de cartón. Abrimos la puerta de acceso que está cubierta con cinta adhesiva y añadimos con cuidado nuestros mosquitos para ayudar a que tus mosquitos sobrevivan.

Debes agregar una bola de algodón que haya sido casada con una solución de sacarosa al 10% que actúe como fuente de alimento para los mosquitos mientras están aquí. Y una toalla de papel húmeda doblada. Dado que los mosquitos heridos tienden a secarse, esto ayudará a preservar la humedad y ayudará a la supervivencia de los mosquitos inyectados.

Rematamos esto con una tapa de Petri para contener la humedad y que nuestra toalla de papel y nuestras bolas de algodón permanezcan húmedas. Y luego incubamos esto en condiciones normales de control ambiental. Por lo tanto, la cinética molecular del silenciamiento génico mediado por ARNi varía bastante de un gen a otro.

Y así, para algunos genes, el silenciamiento puede tener lugar en un día y para otros genes, el silenciamiento eficiente no tendrá lugar durante varios días. Las diferencias entre cada gen se pueden medir mediante PCR cuantitativa en tiempo real, y esto monitoreará los niveles de transcripción dentro de sus mosquitos y le dirá cuándo ha logrado un silenciamiento eficiente. Por lo tanto, recomendaría reservar un par de mosquitos inyectados para ese propósito.

Esto también lo ayudará a determinar qué tan eficientes son sus ARN bicatenarios en general, ya sea que usted, sus ARN bicatenarios específicos puedan lograr un silenciamiento eficiente. Y si de hecho estás interfiriendo con los niveles de transcripción, te acabo de mostrar el procedimiento para el silenciamiento génico mediado por ARNi de los mosquitos de Gambia. Este procedimiento consiste en la microinyección de ARN doblete-hebra en el tórax de mosquitos Anole Gabi.

Este procedimiento es importante porque es uno de los residuos más fáciles y efectivos para manipular genes individuales en los mosquitos.