Name: Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprende el silenciamiento génico por RNAi en mosquitos Anopheles gambiae mediante inyección de dsRNA en el tórax. Este protocolo permite estudiar funciones genéticas relacionadas con la resistencia a patógenos del paludismo.

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RNAi mediada por silenciamiento de los genes de los mosquitos requiere preparación previa y la purificación de dsRNAs específicas que se dirigen al gen de interés. Para la síntesis de dsRNA, se recomienda el kit Megascript Ambion que hace uso de un ARN polimerasa T7 mediada por reacción de transcripción in vitro. Para la purificación de dsRNA, se recomienda el kit Qiagen RNeasy. Las muestras de dsRNA deben cuantificarse y ajustado a 3 mg / l en el agua. Otros materiales que se necesitan son: de punta fina pinzas, portaobjetos de vidrio, agujas de vidrio microcapilar, microinyector (usamos Nanoject Drummond II), un microscopio de luz montado encima de un bloque frío, un plato de cristal cubierta de Petri, toallas de papel y un cubo de hielo . Usted también necesitará una manera de recoger los mosquitos y un contenedor adecuado para ellos, junto con una fuente de alimento, como algodón empapado en 10% de sacarosa. <ol><li> Recoja sus mosquitos. Con un aspirador a pilas, reunir a los mosquitos que desee inyectar. Conecte la boquilla con una toalla de papel o de algodón, por lo que no puede escapar de los mosquitos y retirar el depósito. Dado que las temperaturas frías anestesiar a los mosquitos, enterrar el depósito en un cubo de hielo y espere 5-10 minutos para que los mosquitos dejen de moverse. Anestesia también se puede lograr mediante la colocación de la reserva en una habitación fría o en el refrigerador o mediante el uso de CO 2. Durante esos 5-10 minutos, continúe con el siguiente paso. </li><li> Prepare su área de trabajo. Establecer un bloque de superficie plana frío a 2 ° C y colocar una placa de vidrio sobre ella. Aquí es donde los mosquitos se apoyará a medida que se inyectan. Coloque una aguja de vidrio en el microinyector y el uso de su pinza para romper la punta de la aguja a la anchura deseada. Es importante que la anchura es lo suficientemente grande como para permitir suficiente espacio para que el líquido fluya a través a una velocidad razonable, pero es lo suficientemente estrecha como para infligir una herida mínima durante la inyección. Una punta de la aguja bien será lo suficientemente estrecha como para doblar un poco, pero no romperse. Configurar su equipo de inyección para el volumen de salida deseado (por RNAi, usamos 69 nL). Sumerja la punta de la aguja en la muestra y extraer la muestra de líquido en la aguja siguiendo las instrucciones del fabricante. La muestra de líquido puede ser una solución de dsRNA, la suspensión bacteriana, o de otro tipo, el proceso de inyección es el mismo para todos. Insertar un plato Petri de vidrio en el cubo de hielo para que el fondo de la fuente es totalmente en contacto con el hielo. Aquí es donde se va a poner los mosquitos hasta que esté listo para inyectar. </li><li> Prepare su mosquitos. 50-100 mosquitos desde el depósito hasta el plato Petri de vidrio. Use pinzas para su fina a una sola capa, asegurándose de que la mayoría tiene contacto con el fondo del plato frío para mantenerlos anestesiados. Cubrir estos mosquitos con el plato de tapa cuando no esté en uso. Devolver el depósito hasta el cubo de hielo para mantener el resto de los mosquitos anestesiados. </li><li> Monte los mosquitos en el bloque frío. Utilizar su pinza de punta fina para la transferencia de los mosquitos de uno en uno desde la antena a la placa de vidrio montado en el bloque frío bajo el microscopio de luz. Maneje con cuidado los mosquitos, preferentemente por las piernas. Se alinean hasta 30 mosquitos de lado a lado en la diapositiva, por lo que se puede llegar a cada uno de ellos con la microinyector y asegurarse de que cada uno hace contacto con la tapa fría. Asegúrese de que el mosquito se alinean ordenadamente a fin de que a medida que avanza usted sabe que tiene y que no han sido inyectada. Deja mosquitos tratadas en el frío plato de Petri. </li><li> Inyecte el primer grupo de los mosquitos. Mantenga la punta fina pinza de punta en una mano y sostener la microinyector en la otra mano como un lápiz. Use las pinzas para mover el mosquito como sea necesario (manejar por las patas para evitar lesiones) y para mantener constante el mosquito al inyectarse. Esto funciona mejor si se utiliza el fórceps para apoyar a un lado del mosquito que se inyecta desde el otro lado. Introduzca con cuidado sólo la punta de la aguja en el tórax del mosquito. Es mejor que se inyecte en una parte tensa aún delgada de la cutícula para minimizar las lesiones. También, evitar la inyección demasiado profunda; desea sólo la punta para estar dentro del tórax, más inyecciones de causa mayor heridas que pondrá en peligro la supervivencia. Una vez que la punta de la aguja está en posición, presione y suelte el pedal del aparato microinyector que entregará su pre-establecer el volumen de dsRNA. Espera un segundo o dos y retirar la aguja del mosquito. Si una gota de líquido aparece fuera del sitio de la herida, espere unos segundos para que sea absorbido en la herida. Si no se absorbe en pocos segundos, se descarta que los mosquitos y vuelva a intentarlo. Continuar con el proceso de inyección para todos los mosquitos en el portaobjetos de vidrio. </li><li> Guarde sus mosquitos. Cuando haya terminado, coloque los mosquitos inyectan dentro de los contenedores etiquetados (preferimos un litro forrado de cera vasos de cartón cubiertos porred de malla y se fija con bandas de goma y una tapa de cartón). </li><li> Continuar las inyecciones hasta que termine. Siga colocando los mosquitos en la diapositiva, inyección y transferencia de copas hasta que tenga el tamaño de la muestra que usted desea. Responsables de algunas muertes, los principiantes tienen muchos mosquitos mueren por el trauma de la inyección. Esto mejorará con la práctica hasta casi el 100% de su mosquitos sobreviven de la inyección. </li><li> Cuando termine, coloque una toalla doblada, papel mojado encima de la taza con una fuente de alimento y la tapa de la taza con algo para retener la humedad, como una envoltura de plástico o una tapa de plástico Petri. Mosquitos inyectan son propensos a la desecación por lo que la humedad proporcionada por la toalla mojada y retenido por el plástico ayudará a evitar esto. </li><li> Coloca el mosquito en una cámara de ambiente controlado para la incubación. </li></ol> Nota: La eficiencia del silenciamiento génico es muy variable y depende de una serie de factores que incluyen la transcripción y las proteínas a su vez-sobre los tipos y la eficiencia dsRNA absorción por las células y órganos. Hemos encontrado que el silenciamiento se inicia tan pronto como un día después de la inyección y puede durar hasta 6 días después de la inyección. Utilizar métodos de transcripción y las proteínas de detección, como la PCR cuantitativa y Western Blot para validar el silenciamiento. Nota: Hay varias variaciones en varias etapas de la inyección de mosquitos y RNAi mediada por la técnica de silenciamiento génico. Algunas variaciones son descritas por: Boisson, et al (2006) y Blandin, et al (2002)...

<ol><li>Boisson,, et al. , (2006).</li>
<li>Blandin,, et al. , (2002).</li>
</ol>

La eficiencia del silenciamiento génico es muy variable y depende de una serie de factores que incluyen la transcripción y las proteínas a su vez-sobre los tipos y la eficiencia dsRNA absorción por las células y órganos. Hemos encontrado que el silenciamiento se inicia tan pronto como un día después de la inyección y puede durar hasta 6 días después de la inyección. Utilizar métodos de transcripción y las proteínas de detección, como la PCR cuantitativa y Western Blot para validar el silenciamiento.

<table><tbody><tr><td>Megascript</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td></td><td>para la síntesis de ARNdc; reacción de transcripción in vitro mediada por ARN polimerasa T7</td></tr><tr><td>RNeasy</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td>Para la purificación de ARNdc</td></tr><tr><td>ARNdc</td><td></td><td></td><td></td><td>debe cuantificarse y ajustarse a 3 &amp;#x03BC;g/ &amp;#x03BC;L en agua</td></tr><tr><td>pinzas de punta fina</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>laminilla de vidrio</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agujas microcapilares de vidrio</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microinyector</td><td></td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoject II</td><td></td></tr><tr><td>microscopio de luz</td><td></td><td></td><td></td><td>montado encima de una placa fría</td></tr><tr><td>placa de Petri</td><td></td><td></td><td></td><td>cubierta, de vidrio</td></tr><tr><td>toallas de papel</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sacarosa al 10%</td><td>alimento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. gambiae</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>mosquitos</td></tr></tbody></table>

protocolo para ensayos de rnai en mosquitos adultos (a. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio Dimopoulos para inyectar dsRNA en los mosquitos Anopheles gambiae, que albergan el parásito de la malaria. La técnica de la manipulación de la configuración de la inyección y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.

Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

Los enfoques de genética inversa han demostrado ser sumamente útiles para determinar qué genes subyacen a la resistencia a patógenos transmitidos por vectores en los mosquitos. Este video...

Soy Lindsay Garver y soy estudiante de doctorado en el laboratorio del Dr. George Dimopoulos en la Escuela de Salud Pública Johns Hopkins. Y voy a mostrarles cómo realizar el silenciamiento de genes mediado por ARNi utilizando una técnica de inyección. Así que el primer paso es recolectar los mosquitos que vamos a inyectar.Estos son solo ejemplares normales y muy variados de Gabi. Es una mezcla de machos y hembras. Y este es nuestro aspirador de batería.Tiene un ventilador en su interior, que creará succión, atrayendo a los mosquitos a través de esta boquilla hacia este depósito. Entonces desconectamos. Tenemos una pequeña puerta de acceso, que normalmente se tapa con cinta para mantener a los mosquitos en el interior, pero la abrimos e insertamos la boquilla, la encendemos y la usamos para recolectar.Una vez que tenemos los mosquitos dentro, tapamos la parte superior de la boquilla y observamos los mosquitos en el reservorio. Luego, queremos anestesiar a estos mosquitos. Por lo tanto, colocamos este reservorio en un recipiente con hielo, lo cubrimos con hielo y esperamos a que los mosquitos se inmovilicen.Vale, el siguiente paso consiste en inyectar los mosquitos y, para ello, uti

protocol-for-rnai-assays-in-adult-mosquitoes-a-gambiae

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra las técnicas generales utilizadas para criar Anopheles gambiae en el laboratorio. Los métodos para el cuidado de los mosquitos de laboratorio se ha demostrado en todas las etapas del ciclo de vida del organismo a partir de larvas a pupas a los adultos se alimentan de sangre.

Protocolo para la cría de los mosquitos (A. gambiae)

En este protocolo se combinan RNAi mediada por silenciamiento de los genes con...

RNAi mediada por Gene y Derribo<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo de diuresis en Mujeres Adultas<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Los mosquitos

Los análisis de RNA-Seq son cada vez más importantes para identificar los fundamentos moleculares de los rasgos adaptativos en organismos no modelo. Aquí, se describe un protocolo para identificar genes expresados diferencialmente entre mosquitos Aedes albopictus en diapausa y no diapausa, desde la cría de mosquitos, hasta la secuenciación de ARN y análisis bioinformáticos de datos de RNA-Seq.

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático, Aedes albopictus

Los mosquitos transmisores de la malaria tienen una serie de características epidemiológicamente importantes que solo pueden detectarse mediante técnicas moleculares. Utilizando una plataforma de genotipado de SNP basada en MALDI-TOF, desarrollamos un ensayo para detectar simultáneamente múltiples rasgos clave (especie, resistencia a insecticidas, infección por parásitos y elección de huésped) de los vectores de la malaria.

Un ensayo multi-detección para los mosquitos transmisores de la malaria

Aquí se describe un procedimiento para inhibir la función génica en los mosquitos vectores de enfermedades mediante el uso de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que son ingeridas por las larvas.

El quitosano / ARN de interferencia mediada por nanopartículas silenciamiento génico en la enfermedad vectorial larvas de mosquitos

La interferencia de ARN (ARNi) es una herramienta extremadamente valiosa para descubrir la función de los genes. Sin embargo, la capacidad de dirigirse a genes utilizando ARNi durante las etapas preadultas es limitada en el principal vector de la malaria humana, Anopheles gambiae. Describimos un protocolo de ARNi para reducir la función génica mediante inyección directa durante el desarrollo de la pupa.

RNAi gatillo en la entrega<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Las pupas

Este protocolo describe una metodología de microinyección que hemos estandarizado y utilizado durante varios años a entregar cantidades específicas de ácidos nucleicos directamente a la hemolinfa de los mosquitos y las moscas de casa. Este protocolo da lugar a mortalidad mínima inyección y permite dosis correlacionadas medidas de fecundidad.

DsRNA reproducible microinyección y bioensayo de oviposición de mosquitos y moscas de la casa

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil para la modificación de la expresión génica de forma espaciotemporal controlada que permite el análisis genético funcional en Anopheles gambiae. Los procedimientos descritos para el uso de este sistema son una estrategia de clonación semi-estandarizada, sexado y cribado de pupas para marcadores de proteínas fluorescentes y fijación embrionaria.

Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae

Este protocolo proporciona los pasos desde la extracción de ADN hasta la configuración experimental para la PCR digital de gotas (ddPCR), incluido el análisis para la identificación y cuantificación de eventos de unión final no homólogos (NHEJ) en sitios objetivo después de la escisión Cas9 inducida por gRNA y la reparación del ADN. Otros usos de este método incluyen aplicaciones como la detección de polimorfismo y la verificación de variantes de edición de genes.

PCR de gotas digitales para detectar mutaciones de Indels en poblaciones de mosquitos anofelinos modificados genéticamente

Este artículo detalla un protocolo para la identificación rápida de indels inducidos por CRISPR/Cas9 y la selección de líneas mutantes en el mosquito Aedes aegypti utilizando análisis de fusión de alta resolución.

Detección indel tras mutagénesis CRISPR/Cas9 mediante análisis de fusión de alta resolución en el mosquito Aedes aegypti

La administración oral de dsRNA producido por bacterias, un método de administración para la interferencia de ARN (RNAi) que se usa rutinariamente en Caenorhabditis elegans, se aplicó con éxito aquí a mosquitos adultos. Nuestro método permite estudios robustos de genética inversa y estudios de vectores que bloquean la transmisión sin el uso de inyección.

Administración efectiva de ARN oral de interferencia (ARNi) a mosquitos adultos Anopheles gambiae

Aprende el silenciamiento génico por RNAi en mosquitos Anopheles gambiae mediante inyección de dsRNA en el tórax. Este protocolo permite estudiar funciones genéticas relacionadas con la resistencia a patógenos del paludismo.

Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

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