Name: Cultura rebanada de organotípicos que expresan GFP embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de Nervio Periférico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Aprende a preparar rebanadas organotípicas de embriones de ratón que expresan GFP para estudiar el crecimiento de nervios espinales mediante microscopía de fluorescencia en tiempo real.

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Los autores reconocen la fuente original de la idea de llevar a cabo la cultura rebanada en cinco embriones de ratón. Queremos agradecer a Joachim Kirsch por su generoso apoyo científico y Degen Anna para que actúen como nuestros gofer durante el rodaje. Este trabajo fue financiado por la Fundación Alemana de Investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) y la Universidad de Heidelberg (Excelencia racimo redes celulares).

Parte 1: Preparación para el corte y el cultivo. <ol><li> Prepare 10 cm placas de cultivo con corte medio (DMEM, 25% 1x HBSS, el 25% de suero fetal bovino, 0,5% de glucosa, 1 mM de glutamina, 2,5 mM HEPES, pH 7,3) y de 3 cm Millicell-CM-cultura 0.4 micras inserta la membrana y mantener en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Calentar el 4% de bajo punto de fusión de agarosa en PBS en el microondas y mantenerlo en la placa de calefacción para que quede aproximadamente a 37 ° C. </li><li> Llenar 10 cm bacteriológicas placas de Petri con PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mm de KH 2 PO 4) y el lugar en el hielo. </li><li> Configure el dispositivo de refrigeración microtomo o asegurarse de que la bandeja de amortiguación y de refrigeración los elementos se almacenan en el congelador para pre-enfriar. </li></ol> Parte 2: La inclusión de embriones. <ol><li> Diseccionar embriones del útero y las examinan con un microscopio invertido fluorescentes para detectar la expresión de GFP. </li><li> Embriones en lugar de un plato invertido 10 cm Petri y orientarlos con tiras de papel Whatman para eliminar exceso de PBS. </li><li> Aplicar agarosa en el embrión para fijarlo en esa posición. Vamos agarosa solidifique. </li><li> Límite de la zona que rodea el embrión mediante el corte con una cuchilla de afeitar. </li><li> Gire el embrión embebido hacia el otro lado. </li><li> Aplicar más de agarosa en el tejido embrionario para asegurarse de que el embrión está plenamente integrado. </li><li> Prepare bloque de agarosa con bordes limpios y de montaje en vibratome plato con Loctite 406, un pegamento especial similar a la "Krazy Glue". </li></ol> Parte 3: Cortar procedimiento. <ol><li> Configure la bandeja de buffer pre-enfriado y el disipador de calor. </li><li> Inserte el mandril con el tejido pegado y añade 1x HBSS (Ca 2 +-Mg 2 + libre de HBSS, 10 mM HEPES pH 7,3, 500 U / ml de penicilina / estreptomicina) hasta que esté cubierto. </li><li> Insertar y fijar un precleaned (70% etanol) hoja de microtomo. </li><li> Preparar 350 a 450 micras rodajas y transferirlos con pipetas Pasteur de vidrio acortado en placas de cultivo de tejidos se mantienen en hielo. </li><li> Con un par de pinzas, retire con cuidado de cada rebanada de agarosa y transferencia a membranas Millicell cultura. Aproximadamente 4 rebanadas pueden ser cultivadas en una membrana de tejido en una placa de 10 cm de cultura llena de 6 mL de medio de cultivo. </li><li> Incubar cortes a 37 ° C y 5% de CO 2 (medio de cultivo: DMEM, 25% 1x HBSS, el 25% de suero fetal bovino, 0,5% de glucosa, 1 mM glutamina, 2,5 mM HEPES, pH 7,3). Si uno realiza un lapso de tiempo la serie de imágenes se debe mantener el volumen de medio de constantes. En el caso de series de tiempo de imágenes para un corto período de tiempo es suficiente para dejar el medio como es. Para períodos más largos cultura cambia después de 12-20 horas se recomienda. </li></ol> Parte 4: fruto de imágenes del nervio espinal en el microscopio. <ol><li> Imagen de los nervios raquídeos a la colocación de una placa de tejido de 10 cm de la cultura, que contiene las membranas Millicell la cultura con las rebanadas, con un microscopio fluorescente en posición vertical. </li><li> Etiqueta de la orientación de las membranas de la cultura Millicell en platina del microscopio para posicionar correctamente en el punto de imagen la próxima vez. </li><li> Consecuencia la imagen del nervio espinal utilizando 4x (apertura numérica [NA] 0,1), 10x (NA 0,3) o 20x (NA 0.5) objetivos. </li></ol> La figura 1 muestra una serie de imágenes que representan el fruto del nervio espinal durante 20 horas de cultura con los objetivos de 4x y 10x. <img src="/files/ftp_upload/2309/2309fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Imagen serie de consecuencia del nervio espinal en un corte transversal de un embrión tauGPF homocigotos. * = Neuronas motoras de la médula espinal ventral, flecha = DRG. El dorsal (D)-ventral (V), el eje de la rebanada se indica. Scalebars: 200 micras.

<ol><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).</li>
<li>Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+of+identified+projection+neurons+in+cat+visual+cortex+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices.</a> J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).</li>
</ol>

En una amplia comparación de los métodos para preparar cultivos de embriones rebanada de embriones de ratón mitad de la gestación (E10 - E12), hemos observado que un vibratomo produce sin lugar a dudas los resultados más confiables con respecto tanto a la viabilidad general de las culturas y la reproducibilidad de los los patrones de derivación del nervio. Por el contrario, las rebanadas de preparados con un helicóptero del tejido McIlwain 3 resultó ser completamente inviable. Lo que originalmente se empleó u...

<table><tbody><tr><td>HBSS 10x</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14180</td><td></td></tr><tr><td>Herramientas de disección</td><td>Fine Science Tools</td><td>varios</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa L.M.P.</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td></td></tr><tr><td>Papel Whatmann</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas cortas pulidas al fuego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pen Estrep</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 100x</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Vibrátomo</td><td>Microm International</td><td>HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>analySIS</td><td>Soft Imaging System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insertos Millicell-CM</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG 50</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 10 cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633171</td><td></td></tr><tr><td>LOCTITE 406</td><td>Henkel Corp</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de afeitar</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ninguno</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9105.2</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo x4</td><td>Olympus Corporation</td><td>serie PL</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo x10</td><td>Olympus Corporation</td><td>serie UPLFL &amp;#8211;PH</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Olympus Corporation</td><td>U-MNIBA2</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Soft Imaging System</td><td>SIS F-View II</td><td></td></tr><tr><td>Equipo para cámara calefactada</td><td>Leica Microsystems</td><td>CTI-Controller 3700 e incubadora S #11531171</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura rebanada de organotípicos que expresan gfp embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de nervio periférico

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Para muchos fines, el cultivo de embriones de ratón ex vivo como rebanadas organotípicos es deseable. Por ejemplo, contamos con una línea de ratones transgénicos (tauGFP) en la que es exclusivamente la versión mejorada de la proteína verde fluorescente (EGFP) se expresa en todas las neuronas del sistema nervioso en desarrollo de una central y periférico, lo que permite la posibilidad de tanto en cine como la inervación de las patas delanteras y de manipular este proceso con las técnicas farmacológicas y genéticas 2. El parámetro más importante en el cultivo exitoso de las culturas rebanada tal es el método por el cual los cortes están preparados. Después de extensas pruebas de una variedad de métodos, hemos encontrado que un vibratomo es el mejor dispositivo posible para cortar los embriones de forma que de manera rutinaria como resultado una cultura que muestra la viabilidad en un período de varios días, y lo más importante, se desarrolla en una época de manera específica. Para mediados de la gestación de embriones, lo que incluye la consecuencia normal de los nervios espinales de la médula espinal y los ganglios de la raíz dorsal de sus objetivos en la periferia y la correcta determinación de tejido óseo y muscular. En este trabajo se presenta un método para el procesamiento de embriones todo el día embrionario (E) E10 a E12 en 300 a 400 rebanadas micrómetro para el cultivo en un estándar de cultivo de tejidos incubadora, que pueden ser estudiados por hasta dos días después de la preparación rebanada. Fundamental para el éxito de este enfoque es el uso de un vibratome para cortar cada embrión de agarosa embebidos. Esto es seguido por el cultivo de los cortes en la cultura inserta Millicell membrana colocada sobre un pequeño volumen de medio, lo que resulta en una técnica de cultivo de la interfaz. Una camada con un promedio de siete embriones habitualmente produce por lo menos 14 sectores (2-3 porciones de la región extremidad anterior por embrión), que varía ligeramente debido a la edad de los embriones, así como el grosor de las rodajas. Alrededor del 80% de las rebanadas de cultivo muestran consecuencia del nervio, que puede ser medido througout el período de cultivo 2. Los resultados representativos utilizando la línea de ratón tauGFP se demuestran.

Se presenta un método para preparar cortes organotípicos de embriones de ratón mitad de la gestación para el cultivo y la imagen de lapso de tiempo de extensión del nervio periférico.

Cultura rebanada de organotípicos que expresan GFP embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de Nervio Periférico

Para muchos propósitos, es conveniente el cultivo ex vivo de embriones de ratón en forma de cortes organotípicos. Por ejemplo, empleamos una línea de ratones transgénicos (tauGFP) en...

El objetivo general de este procedimiento es preparar cortes transversales organotípicos de la región del miembro anterior de embriones de ratón que expresan GFP, con el fin de obtener imágenes del crecimiento de los nervios espinales. Esto se logra primero incrustando los embriones en agarosa de punto de fusión bajo y limitando el área de tejido y agarosa a la región de interés. Luego, el bloque de agarosa se monta para realizar los cortes. Luego, los embriones embebidos en el bloque se cortan con el vibrátomo. El paso final del procedimiento consiste en retirar los aros que rodean las secciones y transferir las secciones a placas de cultivo. Las secciones se cultivan entonces y muestran un crecimiento de los nervios periféricos hacia la periferia, lo cual puede monitorizarse mediante microscopía de fluorescencia.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la guillotina o el cortador de tejidos es que los cortes se generan de manera más controlada y presentan una viabilidad mejorada en cultivo. Por lo tanto, este método puede ayudar en el estudio de la neurobiología del desarrollo, como observar la orientación y el crecimiento de los nervios espinales, demostrando que el procedimiento será Isabel Barman. Comience este procedimiento preparando placas de cultivo tisular de 10 centímetros con seis mililitros de medio de cultivo e insertos de membrana de cultivo milicelulares de 3 centímetros, 0,4 micrones.Manténgalos en la incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. A continuación, caliente al microondas el agarosa al 4% de punto de fusión bajo en PBS, y manténgalo en una placa calefactora para que permanezca a aproximadamente 37 grados Celsius. Llene placas de Petri bacteriológicas de 10 centímetros con PBS y colóquelas sobre hielo.Luego configure el dispositivo de enfriamiento Viome. Guarde la bandeja de tampón y los elementos de enfriamiento en el congelador hasta que se congelen completamente para realizar el embrión. Primero, incluya por encastre embriones disecados del útero.Examinelos con un microscopio fluorescente invertido y verifique la expresión de GFP. A continuación, coloque los embriones sobre una placa de Petri invertida de 10 centímetros utilizando tiras de papel Watman para orientarlos y elimine el exceso de PBS. Aplique aros sobre el embrión para fijarlo.En la posición orientada, espere a que los aros se solidifiquen, recorte los aros excesivos y, si se desea, el tejido circundante de la porción media del embrión. Gire el embrión embebido hacia el otro lado. Aplique aros adicionales sobre el tejido embrionario para asegurar que el embrión quede completamente embebido.Espere a que los aros se solidifiquen. Prepare un bloque de aros con embriones incrustados y bordes limpios. Finalmente, pegue la muestra en un portamuestras viome con Loctite 4 0 6.Configure la bandeja de tampón preenfriada y los elementos de refrigeración. Coloque el portamuestras con el tejido pegado sobre el viome. Añada una X-H-B-S-S al portamuestras hasta que el tejido quede cubierto.Inserte una cuchilla viome previamente limpiada en el portacuchillas. A continuación, prepare cortes transversales con un grosor de aproximadamente 350 a 450 micrones. Cada corte se realiza con un microtomo HM six 50 V.Transfiera las secciones a placas de cultivo de tejidos con una pipeta Pasteur de vidrio acortada y manténgalas sobre hielo. Utilizando un par de pinzas, retire cuidadosamente las arós de todas las secciones. Luego transfiera las secciones a las membranas de cultivo MilliCell, colocando cuatro secciones en cada membrana, en placas de cultivo de 10 centímetros llenas con seis mililitros de medio de cultivo precalentado.Incube las secciones a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono desde el inicio del microscopio de lapso de tiempo y entre los intervalos de adquisición de imágenes. Coloque la placa de cultivo celular que contiene las membranas de cultivo Milli con las secciones bajo un microscopio fluorescente invertido y localice los nervios espinales; obtenga imágenes del crecimiento de los nervios espinales utilizando objetivos de 4 x, 10 x o 20 x. Etiquete la orientación de las membranas de cultivo Milli en la platina del microscopio para poder reposicionarlas correctamente durante el siguiente punto temporal de adquisición de imágenes, en caso de que no se disponga de un sistema estable de temperatura y dióxido de carbono.El entorno mostrado aquí es una serie de imágenes del crecimiento de los nervios espinales durante 24 horas de cultivo en una sección transversal de un embrión homocigoto para tau GFP. La estrella indica neuronas motoras de la médula espinal ventral y la flecha indica el ganglio dorsal de la raíz (DRG). El panel superior fue obtenido con un objetivo de 4 X y el panel inferior con un objetivo de 10 X.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar cortes transversales organotípicos de embriones de ratón que pueden utilizarse para obtener imágenes del crecimiento de los nervios espinales.

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Aprende a preparar rebanadas organotípicas de embriones de ratón que expresan GFP para estudiar el crecimiento de nervios espinales mediante microscopía de fluorescencia en tiempo real.

Cultura rebanada de organotípicos que expresan GFP embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de Nervio Periférico (Video) | JoVE Journal

Cultura rebanada de organotípicos que expresan GFP embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de Nervio Periférico

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