Cultura rebanada de organotípicos que expresan GFP embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de Nervio Periférico
March 29th, 2011
Se presenta un método para preparar cortes organotípicos de embriones de ratón mitad de la gestación para el cultivo y la imagen de lapso de tiempo de extensión del nervio periférico.
El objetivo general de este procedimiento es preparar cortes transversales organotípicos de la región de las extremidades anteriores de embriones de ratón que expresan GFP para obtener imágenes del crecimiento del nervio espinal. Esto se logra primero incrustando los embriones en aros de bajo punto de fusión y limitando el área de tejido y aros a la región de interés. A continuación, se monta el bloque aros para cortarlo.
A continuación, los embriones incrustados en el bloque se cortan con el vibrador. El paso final del procedimiento es eliminar los aros que rodean las rodajas y transferir las rodajas a placas de cultivo. A continuación, los cortes se cultivan y muestran el crecimiento de los nervios periféricos en la periferia, que se pueden controlar con microscopía de fluorescencia.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como la guillotina o el picador de tejidos, es que los cortes se generan de forma más controlada y muestran una mayor viabilidad en cultivo. Por lo tanto, este método puede ayudar en el estudio de la neurobiología del desarrollo, como observar la guía y el crecimiento de los nervios espinales, lo que demuestra que el procedimiento será Isabel Barman. Comience este procedimiento preparando placas de cultivo de tejidos de 10 centímetros con seis mililitros de medio de cultivo e insertos de membrana de cultivo de tres centímetros milicélulas, 0,4 micras.
Manténgalos en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. A continuación, caliente un 4% de aros de bajo punto de fusión en PBS en el microondas y manténgalo en una placa calefactora para que se mantenga a aproximadamente 37 grados centígrados. Llene placas de Petri bacteriológicas de 10 centímetros con PBS y colóquelas en hielo.
A continuación, configure el dispositivo de refrigeración Viome. Guarde la bandeja tampón y los elementos de enfriamiento en el congelador hasta que estén completamente congelados para producir el embrión. La inclusión disecciona primero los embriones del útero.
Examínelos con un microscopio fluorescente invertido y verifique la expresión de GFP. A continuación, coloque los embriones en una placa de Petri invertida de 10 centímetros utilizando tiras de papel watman para orientarlos y eliminar el exceso de PBS. Aplicar aros sobre el embrión con el fin de fijarlo.
En la posición orientada, espere a que los aros se solidifiquen, recorte el exceso de aros y, si lo desea, el tejido que rodea la parte media del embrión. Gire el embrión incrustado hacia el otro lado. Aplique aros adicionales en el tejido embrionario para asegurarse de que el embrión esté completamente incrustado.
Espera a que los aros se solidifiquen. Preparar el bloque de aros incrustado en el embrión con los bordes limpios. Por último, pegue la muestra en un mandril de viome con Loctite 4 0 6.
Configure la bandeja tampón preenfriada y los elementos de refrigeración. Coloque el mandril con el pañuelo pegado en el viome. Agregue un X-H-B-S-S al mandril hasta que el pañuelo esté cubierto.
Inserte una cuchilla de viome previamente limpiada en el soporte de la cuchilla. A continuación, prepare rodajas transversales con un grosor de aproximadamente 350 a 450 micras. Cada loncha se corta con un micrótomo HM six de 50 V.
Transfiera las rodajas a placas de cultivo de tejidos con una pipeta de vidrio acortada para pastos y manténgalas en hielo. Con un par de pinzas, retire con cuidado los aros de todas las rodajas. A continuación, transfiera las rodajas a las membranas de cultivo de milicélulas con una disposición de cuatro rodajas en cada membrana a placas de cultivo de 10 centímetros llenas de seis mililitros de cultivo precalentado. Medio.
Incubar las rodajas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta el comienzo de la obtención de imágenes en time-lapse y entre los intervalos de obtención de imágenes. Coloque la placa de cultivo de tejidos que contiene membranas de cultivo de células Millie con cortes bajo un microscopio fluorescente vertical y localice los nervios espinales para obtener imágenes del crecimiento del nervio espinal utilizando cuatro objetivos de 10 o 20 x. Etiquete la orientación de las membranas de cultivo de milicélulas en la platina del microscopio para reposicionarlas correctamente durante el siguiente punto de tiempo de obtención de imágenes en caso de que una no tenga una temperatura y un dióxido de carbono estables.
El entorno que se muestra aquí es una serie de imágenes del crecimiento del nervio espinal durante 24 horas de cultivo en un corte transversal de un embrión homocigoto de tau GFP. La estrella indica las neuronas motoras de la médula espinal ventral y la flecha indica DRG. El panel superior se fotografió con un objetivo de cuatro X y el panel inferior con un objetivo de 10 x.
Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar cortes transversales organotípicos de embriones de ratón que se pueden usar para obtener imágenes del crecimiento del nervio espinal.
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Visión general
Este artículo presenta un método para preparar cortes organotípicos de embriones de ratón en mitad de la gestación, dirigidos específicamente a la región de las extremidades anteriores para el estudio del crecimiento de los nervios espinales. El método permite la imagen de lapso de tiempo del desarrollo de los nervios periféricos mediante microscopía de fluorescencia.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Técnicas de imagen
Antecedentes
- Los cortes organotípicos son cruciales para estudiar el crecimiento de los nervios en un ambiente controlado.
- Los embriones de ratón que expresan GFP proporcionan un marcador visual para el desarrollo de los nervios.
- La microscopía de fluorescencia permite el monitoreo en tiempo real del crecimiento de los nervios periféricos.
- Entender el crecimiento de los nervios es esencial para obtener información sobre los procesos de desarrollo y posibles aplicaciones terapéuticas.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método confiable para preparar cortes organotípicos de embriones de ratón.
- Facilitar la imagen del crecimiento de los nervios espinales en un entorno de laboratorio.
- Mejorar la comprensión del desarrollo de los nervios periféricos.
Métodos utilizados
- Incorporación de embriones de ratón en mitad de la gestación en aros de punto de fusión bajo.
- Limitación del área de tejido a la región de interés para un estudio enfocado.
- Cortar el bloque de aros que contiene los embriones utilizando un vibratomo.
- Transferir los cortes a placas de cultivo para observación.
Resultados principales
- Preparación exitosa de cortes organotípicos de embriones de ratón.
- Observación del crecimiento de los nervios periféricos hacia la periferia.
- Uso efectivo de la microscopía de fluorescencia para monitorear el desarrollo de los nervios.
- Demostración de la viabilidad de los cortes para períodos de cultivo prolongados.
Conclusiones
- El método proporciona una herramienta valiosa para estudiar el crecimiento de los nervios periféricos.
- Los cortes organotípicos pueden ser utilizados para varias aplicaciones experimentales en neurociencia.
- Este enfoque puede llevar a nuevas percepciones sobre el desarrollo y la regeneración de los nervios.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method enables real-time imaging of peripheral nerve outgrowth in organotypic slice cultures, providing a controlled system for evaluating neuroactive compounds and genetic manipulations. It supports target validation in neurodevelopmental pathways by allowing direct visualization of axonal growth and guidance mechanisms. The approach enhances predictive confidence in early discovery by modeling age-specific nerve development in a reproducible, physiologically relevant format.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to axonal guidance and nerve outgrowth mechanisms.
- Operational Value: Provides a neuron-specific readout via GFP expression for functional target validation in developing peripheral nervous system.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by allowing real-time monitoring of neurogenic responses to pharmacological or genetic perturbations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized 300-400 micrometer slices with consistent viability for up to two days in culture.
- Quantitative Output: Enables measurement of nerve outgrowth throughout the culture period using fluorescence microscopy.
- Scalability: One litter yields ~14 slices, supporting medium-throughput screening of compound effects on neurite extension.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models peripheral nerve development processes applicable to neuropathic injury and regeneration studies.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical assessment of neuroregenerative compounds.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go determinations based on observed nerve outgrowth patterns in a disease-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in neurodevelopmental biology and enabling lead identification through quantitative nerve outgrowth analysis.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and biological de-risking of targets involved in spinal nerve guidance and peripheral innervation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence-based readouts suitable for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides time-lapse imaging data that enables statistical comparison of outgrowth dynamics across experimental conditions.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical models by maintaining age-specific developmental processes in slice culture.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neurotoxicity, neuroregeneration, and target validation studies across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through direct visualization of peripheral nerve development in a genetically tractable system.
- Operational Value: Ensures reproducibility via vibratome-based slicing and standardized culture conditions on Millicell inserts.
- Strategic Value: Improves portfolio triage by reducing mechanistic ambiguity in neurodevelopmental target engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions based on validated nerve outgrowth phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo dissection, fluorescent microscopy, and vibratome sectioning.
- Dependent on low melting point agarose, vibratome equipment, and sterile culture infrastructure.
- Necessitates standardization across teams for slice thickness, culture timing, and imaging parameters.
- Adaptation to other model systems may require optimization of embedding and slicing parameters.
- Practical limitations include slice viability window (~2 days) and dependence on transgenic GFP expression for visualization.
