Las grabaciones fisiológicas de NMJs de salida de alta y baja en el músculo extensor de piernas cangrejo de río

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo exponer y distinguir los terminales motores fásicos y tónicos mediante tinción morfológica y grabación electrofisiológica en el músculo extensor del cangrejo de río. Esto se logra primero pellizcando la primera o segunda pata caminadora de un cangrejo de río de tamaño medio, extrayendo la cutícula y eliminando el músculo flexor en el segmento meita. Esto expone el músculo extensor y el haz nervioso.

El segundo paso del procedimiento consiste en teñir la preparación con yoduro de tetraetilamino estéril y metilperitonio, o tetra D dos asp, para visualizar los axones y terminales nerviosos. El tercer paso del procedimiento es estimular selectivamente neuronas tónicas y/o fásicas, y simultáneamente realizar grabaciones intracelulares de PSEPs evocados en la fibra muscular. El paso final del procedimiento consiste en utilizar un electrodo focal para registrar eventos cuánticos espontáneos y evocados provenientes de los terminales.

Finalmente, se pueden obtener resultados que diferencien morfológica y fisiológicamente las terminaciones tónicas y fásicas mediante microscopía de inmunofluorescencia y electrofisiología. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología sináptica en áreas como la fatiga muscular, la depresión sináptica y la comunicación cruzada sináptica. El experimento comienza seleccionando cuidadosamente el cangrejo de río de manera que se eviten sus pinzas.

Desprenda la pata del cuerpo en el segmento del podio isquial. Un apretón fuerte en el segmento del podio isquial induce al cangrejo de río a autotomizarse o desprenderse naturalmente de la primera pata ambulatoria. El cangrejo de río dejará de sangrar y se devolverá a su tanque de contención.

No se sacrifica el cangrejo de río. Coloque la pata sobre un trozo de papel de tejido para que la preparación pueda girarse fácilmente mientras se realizan los cortes. Gire la pata hasta que el exterior, que es el lado lateral, quede hacia arriba sobre la placa de disección.

Esto generalmente tiene el lado arqueado orientado hacia arriba. Utilizando una cuchilla de afeitar afilada sujeta a un rompedor de cuchillas de bisturí, raye la cutícula dentro del segmento meita siguiendo el patrón mostrado en la figura. Tenga cuidado de no cortar demasiado distalmente en el corte de dorsal a ventral a lo largo de la articulación carpod del meita.

Este corte crea una ventana en el meite por encima de los músculos de la pata subyacentes. Deje la cutícula en su lugar por ahora. Coloque la preparación en un recipiente de disección que contenga solución salina fisiológica para cangrejo de río.

En este momento, coloque un alfiler en la mitad del segmento carpod y en la cara dorsal del segmento isquia pod con pinzas finas, levante ligeramente la ventana cortada en la cutícula desde el extremo distal y, utilizando la cuchilla, corte las fibras del músculo flexor separándolas de la cutícula. Continúe cortando de forma distal a proximal y, finalmente, levante la ventana de la cutícula. Para exponer el músculo extensor, debe eliminarse el músculo flexor que lo recubre.

Seccione el tendón del músculo flexor desplazándolo del músculo flexor con un alfiler. Luego corte el tendón en la articulación metacarpo-carpiana. Como se muestra, tenga mucho cuidado de tirar del tendón lejos de la cavidad de la pata antes de realizar el corte, y asegúrese de cortar solo el tendón y no el nervio principal de la pata que se encuentra en el lado interno del tendón.

Pinche el tendón en el lugar donde fue cortado con pinzas y separe el músculo flexor de la pata levantándolo en dirección codo. Para exponer el nervio del músculo extensor, corte el nervio principal de la pata en la articulación meropodio-carpodáctila y retire cuidadosamente el nervio principal de la pata sobre el músculo extensor. La separación del nervio del músculo extensor respecto al nervio principal de la pata puede mejorarse tirando suavemente del muñón distal del nervio principal de la pata hacia un lado de la preparación. Al retirar el nervio principal de la pata sobre el músculo extensor, puede ser necesario cortar pequeñas ramas del axón inhibitorio.

El haz nervioso puede visualizarse mediante tinción con azul de metileno. Sin embargo, el azul de metileno no se utilizaría para grabaciones electrofisiológicas en esta imagen superior. Flechas rojas para marcar la trayectoria nerviosa de interés.

El haz nervioso de interés es el haz más grande que se ramifica del nervio principal de la pata cerca del extremo proximal de donde se encuentra el meropodito. Observe la ramificación de los axones y los dos axones fácilmente visibles dentro del nervio. Ahora que el nervio y el músculo están expuestos, prepare el aparato utilizado para el experimento.

Las grabaciones intra y extracelulares se realizan con una etapa de cabeza y un amplificador estándar. Utilizamos un amplificador modelo Axon Clamp dos B y una etapa de cabeza uno XLU. Se necesitan tres electrodos, uno intracelular y dos extracelulares.

Los dos electrodos extracelulares se utilizarán para estimular el nervio y registrar eventos sinápticos evocados y espontáneos. Pule por llama los electrodos focales y dóblelos ligeramente sobre un elemento calefactor. Después de llenar un electrodo focal con solución salina, colóquelo en el porta-electrodo estimulador e inserte el cable del estimulador de modo que haga contacto con la solución salina.

Esto está conectado a una unidad de aislamiento de estimulación P 15 de grass, que a su vez está conectada a un estimulador S 88 de grass. Durante las grabaciones electrofisiológicas, se utiliza el colorante vital para D dos ASP para visualizar los axones y teñirlos; intercambie la salina del baño con salina que contenga cinco micromoles de cuatro D dos ASP por colorante durante cinco minutos. Después de cinco minutos, rellene nuevamente el recipiente con salina fisiológica de cangrejo de río, coloque la preparación bajo un microscopio y utilice un objetivo Forex.

Y con un ocular de 10 x, mueva el electrodo estimulante al área de interés. El siguiente paso consiste en colocar la luz del electrodo estimulante de parche macro sobre el axón fásico o tónico. Esta fotografía de una preparación teñida con cuatro colorantes, dos de los cuales son colorantes de axones, muestra que el axón tónico es más visible debido al mayor contenido mitocondrial.

Los terminales tónicos presentan numerosas varicosidades y los terminales fásicos son de naturaleza más delgada bajo microscopía de fluorescencia. Y el objetivo de 20 x coloca el electrodo en el axón tónico o fásico. Aquí el electrodo se está colocando en el axón tónico.

Coloque el electrodo intracelular en su micromanipulador y colóquelo dentro de una célula muscular extensora. Esto se utilizará para registrar potenciales postsinápticos excitatorios intracelulares o EPSP. Para la grabación de EPSP cualitativos.

Coloque el segundo electrodo focal en un micromanipulador. Para ello, retire el electrodo intracelular anterior y su soporte, y sustitúyalo por un soporte de electrodo limpio. Utilice el micromanipulador para colocar la luz del segundo electrodo focal directamente sobre una varicosidad sináptica.

La resistencia del electrodo y de la selladura se determina pasando pulsos de corriente de prueba a través del electrodo. En nuestros experimentos, las resistencias de selladura oscilaron entre 0,3 y un mega ohmio, y el rango de resistencia del electrodo fue de 0,5 a uno. La resistencia de selladura en mega ohmios puede monitorearse durante toda la grabación.

Cuando esté listo para comenzar la estimulación, encienda el software scope 5.0 e inicie la estimulación del axón aislado. En el haz nervioso, el axón tónico se estimula mediante el electrodo de succión y los potenciales postsinápticos excitadores (EPSP) de la fibra muscular se registran con un electrodo intracelular o extracelular. Los EPSP se registran en una computadora mediante una interfaz power lab forest.

Tras la estimulación del axón tónico, el electrodo estimulante puede moverse al axón fásico y repetirse el experimento tras la estimulación nerviosa. El electrodo intracelular registra los potenciales postsinápticos excitadores generados en respuesta a la actividad de los motoneuronas tónicos y fásicos. La facilitación sináptica de las uniones neuromusculares tónicas depende de la frecuencia de la estimulación nerviosa, como se muestra aquí para trenes sucesivos de aproximadamente 20 estímulos cada uno a una frecuencia de 60 hertz.

Observe la facilitación que ocurre con múltiples estímulos. Esta figura compara las amplitudes de los PEPS generados por la estimulación del nervio tónico a frecuencias de 20 hercios en azul, 40 hercios en verde y 60 hercios en rojo; observe la marcada facilitación mostrada a frecuencias más altas de estimulación. Los terminales tónicos tienen baja eficacia sináptica, pero muestran respuestas facilitadas muy evidentes.

Aquí se muestran los EPSP tónicos por separado, y luego se superponen las respuestas fásicas a la misma escala. En contraste con los terminales tónicos, los terminales fásicos tienen una alta eficacia cuantal, pero muestran depresión sináptica con estimulación de alta frecuencia. La depresión sináptica en los terminales fásicos también está relacionada con la frecuencia de estimulación, como se muestra aquí.

Una estimulación continua de cinco hercios durante 30 minutos deprime la respuesta en la unión neuromuscular. Con una frecuencia de estimulación más alta, la preparación se deprimirá más rápidamente con la estimulación adecuada. La unión neuromuscular del cangrejo de río genera EPSPs sin potenciales de acción.

Estos PEPS pueden utilizarse para investigar las propiedades cualitativas que componen las señales eléctricas graduadas en estos músculos. Aquí se muestran las respuestas sinápticas cualitativas del terminal tónico. Tenga en cuenta que no todos los ensayos de estimulación producen un evento cualitativo.

El conteo directo de eventos cuánticos es posible con una estimulación de baja frecuencia para cada respuesta evocada. El número de eventos cuánticos puede determinarse fácilmente para las terminaciones tónicas. Al contar los eventos cuánticos, las respuestas sinápticas del motoneurona fásico pueden registrarse de la misma manera.

Sin embargo, las respuestas evocadas son de naturaleza multical. El contenido cal medio se estima utilizando la amplitud media o el área de las desviaciones junto con la amplitud pico media o el área de los eventos espontáneos. Un recordatorio final: tenga cuidado al retirar el músculo flexor para no dañar el nervio que inerva el músculo extensor.

Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.