Los potenciales de membrana, las respuestas sinápticas, circuitos neuronales, neuromodulación y la histología muscular utilizando el cangrejo de río: Los ejercicios de laboratorio para estudiantes

Los objetivos generales de los siguientes experimentos son comprender las propiedades de las membranas excitables y la base iónica del potencial de membrana en reposo, y aprender métodos para medir el potencial de membrana, así como demostrar las propiedades de la transmisión sináptica. En una parte del experimento, se medirá el potencial de membrana en reposo mientras se altera el potasio extracelular. En otra parte del experimento, se investigarán los mecanismos de diferenciación sináptica mediante el registro de respuestas sinápticas estimuladas en varias unidades motoras.

A continuación, se presenta un circuito neuronal que es fácil de mantener. Esta preparación se puede utilizar para la enseñanza, así como para la investigación de diversos aspectos de un circuito sensorial al SNC, a la neurona motora y al músculo. Este conjunto de experimentos muestra la facilidad de usar el modelo de cangrejo de río para abordar problemas relacionados con la integración y transmisión sináptica del potencial de membrana, y las diferencias estructurales de los tipos de fibras musculares.

Las principales ventajas de utilizar la preparación de cangrejos de río en la enseñanza de conceptos y técnicas electrofisiológicas son la facilidad de disección, la viabilidad de la preparación de solución salina mínima, la facilidad de obtener respuestas sinápticas y la facilidad de discernir la disposición anatómica general de los músculos. Estas técnicas también se pueden aplicar a otras preparaciones y mejorarán nuestra comprensión de la fisiología y modulación sináptica y las diferencias bioquímicas y estructurales en la preparación demostrada. Para comenzar la cirugía, seleccione un cangrejo de río de aproximadamente seis a 10 centímetros de largo corporal y colóquelo en hielo picado durante cinco minutos para anestesiarlo para decapitar al cangrejo de río, sujételo desde la parte posterior de la cabeza, asegurándose de mantener los dedos fuera del alcance de las pinzas y la boca del cangrejo de río con unas tijeras grandes.

Retire rápidamente la cabeza haciendo un corte limpio desde detrás de los ojos del cangrejo de río, retire las patas y las garras del cangrejo de río para evitar lesiones. Quítese los estilos en los machos y las tetas de nadador tanto en los machos como en las hembras. Deseche la cabeza y los apéndices.

A continuación, separa el abdomen del tórax haciendo un corte a lo largo de la membrana articular, que une el abdomen y el tórax. Guarde la parte abdominal del cangrejo de río y deseche el tórax, apuntando las tijeras ligeramente hacia abajo hacia el lado ventral y, en ángulo, haga un corte en la cáscara a lo largo del borde lateral inferior de cada lado del abdomen. Tenga cuidado de no cortar demasiado profundamente el cangrejo de río.

Siga el patrón natural del caparazón de las líneas de los cangrejos de río que corren a lo largo de cada segmento con pinzas. Retire la parte ventral de la cáscara tirando de ella hacia arriba y hacia atrás. Teniendo cuidado de no destruir los músculos abdominales.

Retira los músculos flexores. En este punto, se puede ver una masa blanca de tejido en la parte superior de los músculos flexores profundos. Retire este tejido cuidadosamente con pinzas.

El tracto gastrointestinal ahora es visible como un pequeño tubo que corre a lo largo de la línea media de los músculos flexores profundos. Retíralo pellizcándolo con pinzas en la parte superior y tirando de él para separarlo del abdomen. Corta la parte inferior del tracto gastrointestinal al final de la cola.

Enjuague la disección con solución salina para asegurarse de que los desechos fecales no interfieran con la preparación. Usando clavijas de disección, fije las esquinas superior e inferior de la preparación a una placa de Petri recubierta con protector S. Los músculos extensores abdominales ahora están expuestos.

Vierta la solución salina en la placa de Petri para cubrir la preparación hasta que se realicen los registros intracelulares. Mueva la placa de Petri al microscopio y use cera debajo de la placa para evitar que se mueva. En esta figura se muestra el aparato utilizado para los registros intracelulares.

Las conexiones y configuraciones apropiadas se dan en el texto adjunto. Configure el software de gráficos de laboratorio de acuerdo con las instrucciones. En el texto adjunto, coloque el cable de tierra en el baño de solución salina.

Coloque la punta de una micropipeta de vidrio llena de cloruro de potasio de tres molares en el baño salino y pruebe la resistencia del electrodo. La resistencia del electrodo debe ser de 20 a 60 mega ohmios. Utilice la perilla gruesa del amplificador para mover la línea en el gráfico de laboratorio a cero bajo iluminación de alta intensidad.

Mire a través del microscopio e identifique los músculos DEM longitudinales. Utilice la sonda de electrodo para insertar el electrodo intracelular en una fibra muscular del músculo DEM. El electrodo apenas debe insertarse en la fibra muscular.

Tenga cuidado de no penetrar completamente a través de la célula. Mide la amplitud del potencial de reposo. Arrastre el cursor M al trazado desde la ubicación en la esquina inferior izquierda de la ventana del gráfico.

Coloque el marcador M en la línea de base y mueva el cursor al punto más bajo de la señal grabada. La diferencia entre el marcador y el cursor activo se muestra en la parte superior derecha de la pantalla. Este valor es el voltaje del potencial de membrana en reposo.

Divida el voltaje registrado por la cantidad de amplificación, en este caso se utilizó una amplificación de 10 x. Luego convierta el voltaje de voltios a milivoltios. Después de registrar el potencial de reposo de esa fibra muscular, mire a través del microscopio y retire con cuidado el electrodo de la fibra muscular.

Repita el registro intracelular en otras fibras musculares. La siguiente parte de este experimento monitoreará el efecto de aumentar la concentración de potasio extracelular en la membrana en reposo. Se utilizarán seis soluciones salinas potenciales para cangrejos de río con concentraciones de potasio de 5,4, 20, 40, 60, 80 y 100 milimolares.

Elija un músculo que no esté temblando para hacer el siguiente registro intracelular entre grabaciones. Reemplace la solución de baño con la siguiente concentración más alta de solución de cloruro de potasio. Asegurándose de cubrir la preparación por completo cada vez.

Registre los cambios en el potencial de membrana para cada solución. El efecto de aumentar la concentración de potasio extracelular, el potencial de membrana se muestra en este gráfico de captura de pantalla de los potenciales de membrana en reposo para cada concentración de potasio en un gráfico semilogarítmico de concentración de potasio extracelular frente al potencial de membrana. Alinee el potencial de reposo en 5.4 milimolares de potasio extracelular.

Para las curvas hipotéticas y observadas, compare la pendiente de la recta observada con la pendiente de la recta hipotética. Después de terminar estos registros electrofisiológicos, el siguiente paso es examinar la anatomía de las fibras musculares y su patrón de inervación. Transfiera la preparación al plato de pie y agregue azul de metileno.

Después de cinco minutos, retire el azul de metileno y agregue solución salina fresca de cangrejo de río. Busca el nervio principal que inerva los músculos dentro de un segmento. Dibuje el patrón de inervación para los músculos S-E-M-D-E-L 2D, EL, uno y DEM en un segmento.

A continuación, mueva la preparación debajo de una campana extractora. Retira la solución salina y añade el fijador. El fijador utilizado aquí es una solución de punta.

El propósito de la campana extractora es evitar los vapores del fijador. Tenga mucho cuidado de que esta solución no entre en contacto con la piel o los ojos. Si sus ojos comienzan a arder, lávese los ojos inmediatamente en la estación de lavado de ojos.

Deje que la solución de boin permanezca en la preparación durante unos 10 minutos y luego use una pipeta para cambiar la solución por solución salina. Corta un segmento delgado de músculo DEL uno o DEL dos. Colócalo en un portaobjetos de vidrio.

Etiqueta la diapositiva. Repita el procedimiento para el músculo SEM. Utilice el microscopio compuesto para ver el patrón de bandas del sarcómero en ambas preparaciones de tejido.

La próxima serie de experimentos examinará cómo registrar las respuestas sinápticas en los músculos abdominales de los cangrejos de río. Selecciona otro cangrejo de río, decapitalo. Extirpar el tórax y los apéndices y exponer los músculos extensores abdominales como se muestra en la cirugía.

En la primera sección de este video, usando el microscopio, encuentre el nervio que lleva los axones motores a los músculos extensores. Busca el segmento con el nervio más accesible. El nervio es blanco y se puede ver usando una pipeta para rociar solución salina sobre la preparación o soplando ligeramente sobre la preparación.

Esto hace que el nervio se mueva y, por lo tanto, sea más fácil de identificar. Coloque el electrodo de succión sostenido por el manipulador de micrómetros directamente sobre el nervio. Tire suavemente de la jeringa para introducir el nervio en el electrodo.

A través del microscopio se puede ver cómo se succiona el nervio en el electrodo. Ajuste la configuración en el software de gráficos de laboratorio como se especifica en el artículo adjunto. Llene un microelectrodo de vidrio de cloruro de potasio de tres molares y conéctelo a la etapa principal y al laboratorio de energía.

Utilice la perilla de curso en el amplificador para mover la línea en el gráfico de laboratorio a cero. Antes de insertar el electrodo, la perilla de palanca debe encenderse y luego apagarse varias veces. Para probar la resistencia del electrodo, mida la amplitud de los valores resultantes.

Mire a través del microscopio y use la sonda del electrodo para insertar el electrodo en una de las fibras musculares longitudinales, ya sea DEM o DL uno o DL dos. Tenga cuidado de no penetrar a través de la fibra muscular. La preparación ya está lista para el experimento.

El electrodo de succión se usa para estimular el haz nervioso segmentario y el microelectrodo de vidrio se usa para registrar la respuesta sináptica de la fibra muscular y desencadenar el estimulador del injerto para estimular el nervio a un hercio para respuestas fásicas. A continuación, coloque el electrodo en una fibra muscular SEL. El SEL es un músculo tónico.

Estimula el nervio con ráfagas cortas de pulsos a 10 hercios para obtener respuestas tónicas. Compare las respuestas registradas de los músculos DEL y SEL. Nótese que los músculos DEL fásicos tienen respuestas sinápticas de mayor amplitud que los músculos TÓNICOS SEL.

Este siguiente conjunto de experimentos se centra en los músculos flexores del cangrejo de río en lugar de los músculos extensores. Comenzando con un nuevo cangrejo de río, aísle el abdomen como se muestra en esta cirugía. En la primera sección de este video, coloque la preparación de cola aislada en una placa de Petri llena de solución salina, sujete la cola y la parte superior de la preparación.

Tenga en cuenta que los experimentos de dec Caro en los músculos flexores tónicos, el cordón nervioso ventral debe dejarse intacto. Utilice un bisturí para iniciar un corte longitudinal a través de la membrana articulada entre dos costillas en el lado ventral de la preparación. Tenga mucho cuidado de no cortar demasiado profundamente al hacer este corte, ya que un corte profundo podría atravesar la raíz nerviosa motora para garantizar que los músculos superficiales no se dañen.

Realiza el siguiente paso. Mirando a través de un microscopio con tijeras o un bisturí cortado horizontalmente desde el corte longitudinal en la fina capa de membrana que cubre el músculo. Amplíe el corte para hacer un colgajo de membrana articulada y levante el colgajo hacia arriba.

Use tijeras para cortar el colgajo, exponiendo los músculos flexores superficiales para el registro intracelular de los músculos flexores superficiales. Utilice la misma instrumentación y configuración que se utilizó para registrar el potencial de membrana en reposo y las respuestas sinápticas de los extensores abdominales. Al igual que antes, utilice un electrodo intracelular lleno de cloruro de potasio de tres molares.

Inserte el electrodo en una fibra muscular de los músculos flexores superficiales, teniendo cuidado de no penetrar a través del músculo. Registrar la actividad espontánea de los EPSP. Tenga en cuenta los diferentes tamaños de los EPSP y si hay algún IPSP presente.

Tome un pincel pequeño y cepille con cuidado el borde de la cutícula dentro del mismo segmento que contiene el electrodo de registro. Observe cualquier cambio en la frecuencia o el tamaño de los EPSP debido a la estimulación si se observa una mayor respuesta. Esto indicaría el reclutamiento de neuronas motoras adicionales que responden al cambio en la activación de los nervios sensoriales.

Cambie cuidadosamente la solución salina del baño por una que contenga un neuromodulador, como un micromolar de serotonina o solución salina burbujeada con dióxido de carbono. A continuación, repita la estimulación con el pincel. Tenga en cuenta el efecto que tiene el cambio de la solución de baño en la actividad registrada.

Cambie la solución salina del baño a solución salina normal y observe que la actividad de la fibra muscular vuelve a la línea de base. Esta figura muestra las EPSP registradas en una fibra muscular flexora superficial. Tenga en cuenta los diferentes tamaños de los EPSP.

La siguiente etapa de este experimento utiliza un electrodo extracelular para monitorear los potenciales de acción de las neuronas motoras que responden a la actividad en el circuito sensorial del SNC a la neurona motora. Comience haciendo un electrodo de succión para estimular los nervios sensoriales. Coloca un pedazo de tubo de plástico sobre una llama.

El siguiente paso es recortar el tubo al tamaño deseado. Para ello, tendrá que observar el nervio en su preparación para juzgar el diámetro de apertura deseado para su electrodo de succión. Dependiendo del tamaño del cangrejo de río, los haces de nervios pueden variar en tamaño desde aproximadamente un milímetro hasta unos pocos milímetros de diámetro.

Corta la sección estirada del tubo para que la abertura de la punta tenga el tamaño correcto para sostener el nervio. Si la abertura es demasiado grande, el nervio podría caerse. Si la abertura es demasiado pequeña, el nervio podría dañarse por la presión del electrodo.

Coloque el tubo de plástico en la punta de un electrodo de vidrio suc. La electrofisiología y la configuración del software son ligeramente diferentes de la monitorización de las respuestas extracelulares en comparación con la configuración de los registros intracelulares. El equipo, tal y como se especifica en el artículo adjunto, aspira la tercera vía que inerva el músculo flexor superficial en el electrodo de succión.

Ahora puede comenzar a registrar los potenciales de acción. Esta ruta tiene cinco neuronas motoras excitadoras y una neurona motora inhibidora. Después de registrar la actividad basal, estimule la cutícula con un cepillo para observar el cambio en los potenciales de acción generados.

Después de esto, reemplace la solución de baño con neuromoduladores como la serotonina como en el experimento anterior y registre cualquier cambio en la respuesta. En el texto adjunto se dan ejercicios adicionales. Esta grabación muestra los potenciales de acción registrados desde la tercera vía antes y durante la estimulación de la cutícula con un cepillo, comparando la frecuencia de los potenciales de acción antes del cepillado con su frecuencia durante la estimulación.

Este registro muestra los potenciales de acción registrados desde la tercera ruta en solución salina normal y en una solución de serotonina. Compare la frecuencia de los potenciales de acción en solución salina normal con su frecuencia y serotonina como se acaba de mostrar. El cepillado aumenta la frecuencia de disparo con respecto a la línea de base.

También se ha demostrado que la serotonina aumenta la frecuencia de disparo con respecto a la solución salina normal. Esta figura muestra que cuando se combinan el cepillado y la serotonina, hay un aumento aún mayor en la frecuencia de disparo. La comparación de los efectos externos y teóricos de la concentración externa de potasio sobre el potencial de membrana en reposo indica la influencia de los iones sobre el potencial de membrana.

También te hemos mostrado cómo registrar las respuestas ntic en las uniones neuromusculares de los músculos fásicos y tónicos. Estas técnicas se pueden utilizar en los laboratorios de los estudiantes de investigación para enseñar conceptos fundamentales y fisiología. Las técnicas obtenidas en este ejercicio de laboratorio pueden utilizarse para responder preguntas relacionadas con otros preparados de laboratorio, así como aplicaciones fisiológicas relacionadas con la medicina y la salud.