Modelado de membranas biológicas con placas de circuitos y medición de señales eléctricas en los axones: Ejercicios de laboratorio para estudiantes

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo se pueden comprender las membranas biológicas utilizando modelos eléctricos y mostrar los procedimientos para registrar potenciales de acción del cordón nervioso ventral del cangrejo de río. Esta demostración utiliza primero componentes de un circuito en una placa de pruebas para representar las propiedades eléctricas de las membranas. El segundo paso del procedimiento consiste en variar la resistencia y la capacitancia en un circuito modelo para observar los efectos sobre las trazas de voltaje.

El tercer paso del procedimiento consiste en aplicar los conceptos aprendidos a partir de un circuito modelo a una preparación nerviosa viva. El paso final del procedimiento es registrar potenciales de acción compuestos y comprender las propiedades de los períodos refractarios umbral y de la transmisión sináptica. En última instancia, los resultados muestran cómo el estudio de modelos de circuitos eléctricos de membranas biológicas y de las propiedades de nervios vivos puede ser una herramienta útil para la enseñanza, como se demuestra mediante la alteración de los componentes de un circuito modelo y la variación de la estimulación del nervio vivo.

Este método puede proporcionar una comprensión sobre cómo las membranas biológicas pueden interpretarse en términos de modelos eléctricos. Asimismo, puede aplicarse a otros tejidos, como el músculo Visual. La demostración de este método es fundamental, ya que la disección del cordón nervioso ventral y el montaje del registro pueden resultar difíciles al principio, y es necesario tener cuidado para no dañar los nervios, a fin de obtener un buen montaje para estimular y registrar del cordón nervioso.

En la primera parte del experimento, se utilizan resistores y capacitores para simular la actividad eléctrica de la membrana de la célula nerviosa. El circuito inicial tiene únicamente resistores. Los capacitores se añaden en una etapa posterior.

Las propiedades resistivas pasivas de la membrana nerviosa están representadas por el circuito mostrado aquí. La protoboard está configurada con resistencias en paralelo de 33 kiloohmios, que representan la resistencia transversal de la membrana, y resistencias en serie de 10 kiloohmios que representan la resistencia intracelular. Este circuito supone que la resistencia del fluido externo es despreciable en comparación con las resistencias intracelular y transversal de la membrana.

Cuando su célula modelo esté completa, conecte los cables de salida del laboratorio de alimentación a la maqueta del protoboard. El laboratorio de alimentación genera el estímulo y tiene una sonda de medición para registrar el voltaje. A continuación, conecte el laboratorio de alimentación al ordenador.

La computadora se utiliza para mostrar las señales eléctricas registradas desde la protoboard. El siguiente paso consiste en configurar el software de la computadora que controlará el estímulo enviado por el laboratorio de potencia a la célula nerviosa modelo. Abra el programa de gráficos de laboratorio desde el escritorio.

Seleccione nuevo archivo, seleccione configuración y luego configuración de canal. Seleccione un canal para mostrarlo, a continuación seleccione el panel del estimulador. Se requieren pulsos largos de 1,5 voltios.

Para esta parte del experimento, ajuste la amplitud a un voltio. El laboratorio de potencia emitirá un voltaje que fluctúa entre 0,5 voltios positivos y negativos, lo que resulta en un estímulo pico a pico de un voltio. Establezca la frecuencia en 0,75 hercios y la duración del pulso en un segundo.

Para la configuración de canales, seleccione el canal uno para monitorear, haga clic en el amplificador de entrada y en el cuadro, haga clic en el botón diferencial y establezca el rango en cinco voltios y seleccione Aceptar. El siguiente paso consiste en aplicar una señal eléctrica al modelo de célula nerviosa y examinar la pérdida de la señal a lo largo de la longitud del modelo. Aplique un voltaje en un extremo del circuito entre A y B haciendo clic en iniciar en la computadora.

Mida el voltaje para la primera unidad de longitud a lo largo del axón modelo y monitórelo en la computadora. Mantenga la punta roja del sonda medidora de voltaje fija en el punto A de la placa de pruebas, mientras mueve la otra punta a diferentes ubicaciones entre las resistencias en serie. Observe la caída de voltaje en las ubicaciones más alejadas.

Ahora detenga la grabación pulsando el botón de detener en el ordenador. Mida las diferencias de voltaje guardadas en las trazas almacenadas en el ordenador utilizando el cursor para mover la traza hasta cada pulso registrado. Utilice el cursor marcador M, ubicado en la esquina inferior izquierda, para marcar la parte inferior de la traza y coloque el cursor libre en la parte superior de la traza para medir la diferencia de voltaje.

Lea la medición de la diferencia de voltaje en la pantalla y escríbala en su cuaderno para cada ubicación de medición a lo largo del circuito. El siguiente paso consiste en calcular la constante de longitud para la célula modelo, que se utiliza para describir la disminución exponencial de la señal con la distancia. Represente gráficamente cada valor de la diferencia de voltaje en una gráfica de diferencia de potencial frente a la distancia desde la fuente, donde se considera que los resistores de la membrana constituyen una unidad.

Además de su gráfico, determine la constante de longitud de este circuito. La constante de longitud de una fibra nerviosa se define como la distancia a lo largo de la cual una diferencia de potencial a través de la membrana disminuye hasta el 37 % de su valor original en el punto de origen. Con el fin de simular mejor las propiedades pasivas de cable en fibras nerviosas y musculares, la célula nerviosa modelo se ampliará para incluir componentes resistivos y capacitivos.

No solo existe una resistencia transversal de la membrana en la membrana de la célula nerviosa, sino que también hay una capacitancia de la membrana superficial, que distorsiona la señal de la célula nerviosa. Para simular esto, conecte capacitores de 10 microfaradios en paralelo a la membrana transversal. Resistencias en la placa de pruebas en la computadora.

Configure el estimulador para usar un segundo, un voltio, lo que equivale a un ajuste de amplitud de 0,5 voltios y pulsos de 0,75 hercios. También en la parte superior derecha del panel, establezca la tasa de adquisición en 20 K por segundo. A continuación, haga clic en el canal uno en el lado derecho de la pantalla.

Haga clic en el amplificador de entrada dentro del cuadro. Haga clic en el botón diferencial y establezca el rango en cinco voltios. Haga clic en Aceptar.

Para guardar estos cambios, haga clic en Inicio para comenzar a recopilar datos. Mida los datos en los mismos puntos a lo largo de la placa de pruebas. Después de la recopilación de datos, utilice la ventana de zoom para ampliar el tiempo de subida en uno de los pulsos cuadrados.

Repita el acercamiento según sea necesario para separar la traza. Mida el tiempo que tarda la señal en aumentar desde la línea base hasta la parte superior de la traza de voltaje, justo cuando se estabiliza.

Observe el curso temporal del cambio de potencial y la distorsión de los pulsos cuadrados. También tenga en cuenta si el voltaje medido es superior a 0,2 voltios utilizando el cursor M y el cursor libre como antes; lea el cambio en el voltaje y registre los datos en su cuaderno, asumiendo que el voltaje umbral es de 0,2 voltios. Mida el tiempo que tarda el potencial en alcanzar el umbral en cada resistor de membrana.

Represente sus resultados como tiempo frente a distancia y observe que el aumento en el grosor de la vaina de mielina produce una disminución en la capacitancia de la membrana. Simule esto reemplazando los capacitores de 10 micro ferd en la protoboard por capacitores más pequeños de 0.1 micro ferd. Repita el experimento anterior.

Observe el cambio en el tiempo para alcanzar el umbral con una resistencia seleccionada. Superponga los datos con los condensadores más grandes en la gráfica anterior de tiempo versus distancia. Aumentar el grosor de la vaina de mielina permite que las señales eléctricas suban y bajen más rápidamente en una célula nerviosa y, por lo tanto, incrementa la velocidad de conducción.

En la siguiente parte del experimento, se examinarán las propiedades electroquímicas de los axones en el cordón nervioso ventral del cangrejo de río. Las propiedades de propagación pasiva de la corriente presentadas en los circuitos modelo también se observan en preparaciones vivas. Sin embargo, se necesita un potencial de acción cada vez que una señal debe transmitirse a lo largo de una distancia de unos pocos milímetros, ya que las propiedades eléctricas pasivas de las células atenuarían las señales a esta distancia.

Cuando las señales viajan a lo largo del cordón nervioso ventral del cangrejo de río con diferentes velocidades de conducción, las más rápidas se observarán primero y las más lentas se observarán ligeramente después. Algunas de las señales se sumarán en el registro dependiendo de la población de axones con velocidades de conducción similares. Esta señal eléctrica sumada proveniente de múltiples axones se denomina potencial de acción compuesto.

La siguiente serie de experimentos se centra en registrar potenciales de acción compuestos de nervios de cangrejo de río para obtener el cordón nervioso ventral del cangrejo de río. Primero, prepare los instrumentos para la disección del platillo nervioso y las soluciones salinas. Coloque el cangrejo de río sobre hielo durante aproximadamente cinco minutos para anestesiarlo.

Una vez anestesiado, envuelva la langosta de río en una toalla de papel húmeda y sostenga la langosta de río con una mano, colocando sus pinzas entre el pulgar y el índice. Con la otra mano, realice una incisión con las tijeras a través del rostro, entre las cuencas oculares. Corte hacia abajo desde la incisión hasta que la cabeza quede completamente separada.

Retire las garras y las patas ambulatorias. Haga una incisión en la base del tórax cefálico por encima del abdomen y separe el tórax cefálico. Retire la cola y las natas.

Realice un corte a lo largo de ambos lados de la superficie ventral del abdomen. Tenga cuidado de no dañar los tejidos más profundos. Retire la sección liberada del exoesqueleto hasta la base del abanico caudal para exponer la cuerda nerviosa ventral.

Usando el borde de la pinza, retire cuidadosamente el cordón nervioso ventral por la punta. Tenga cuidado de no estirar ni aplastar el cordón nervioso. Cualquier nódulo observado en el cordón nervioso corresponde a ganglios de cangrejo de río.

Coloque el cordón nervioso sobre las barras metálicas en la cámara nerviosa. Es fundamental mantener el cordón nervioso ventral húmedo. Para lograrlo, agregue suficiente solución salina de cangrejo de río a la cámara nerviosa hasta alcanzar un nivel que iguale al de las barras metálicas transversales.

A continuación, pipete suficiente solución salina para langosta de modo que el nivel del líquido haga contacto justo con la parte inferior de las barras. Una vez que el cordón nervioso esté en su lugar, conecte el cable del estimulador con los dos electrodos en forma de gancho pequeño a la cámara del nervio. Conecte el electrodo rojo positivo a uno de los bucles metálicos externos cerca del extremo del cordón nervioso y conecte el electrodo negro negativo al bucle metálico adyacente que también esté en contacto con el cordón nervioso.

Utilice el manipulador para colocar el electrodo de succión cerca del extremo del nervio opuesto a los cables negativo y positivo. Aspire cuidadosamente la punta de la cuerda nerviosa ventral dentro del electrodo de registro. Conecte el electrodo al cabezal del transductor fijando un cable del electrodo de succión a la entrada positiva del transductor y el otro cable a la entrada negativa.

No importa qué cable se conecte a qué entrada. Se puede conectar la sonda a tierra mediante la jaula de Faraday o el baño de solución salina utilizando un cable de cloruro de plata, o conectarla a la entrada de tierra del amplificador diferencial para reducir el ruido potencial de 60 hertz. Conecte la sonda al amplificador diferencial y conecte el amplificador al laboratorio de energía.

Verifique que la configuración del amplificador RS se muestre en la tabla del artículo adjunto. Utilice el cable USB para conectar el laboratorio de alimentación a la computadora. Abra el software de osciloscopio en el escritorio de la computadora, en la parte superior derecha de la pantalla.

Seleccione el canal dos y apáguelo. Ajuste la pantalla para que solo se muestre el canal uno, arrastrando la barra del centro hasta la parte inferior de la pantalla. Verifique el amplificador de entrada con los ajustes indicados en el artículo adjunto.

Luego, en la configuración situada en la parte superior de la pantalla, seleccione estimulador y desactive el estímulo aislado; establezca el retardo en cinco milisegundos, la duración en un milisegundo, dos pulsos, un intervalo de 15 milisegundos, un rango de cinco voltios y una amplitud de 0,5 voltios. Para comenzar a estimular el cordón nervioso ventral, haga clic en el botón de inicio situado en la esquina inferior izquierda de la pantalla. Debe aparecer un potencial de acción claramente definido en el cuadro de recopilación de datos del osciloscopio.

Dibuje la forma general del potencial de acción en su cuaderno. Disminuya lentamente el voltaje utilizando la pestaña en la parte superior izquierda de la pantalla. El potencial de acción debe hacerse más pequeño en magnitud hasta que su patrón de onda característico desaparezca.

Disminuir el voltaje reduce el número de neuronas reclutadas para contribuir al potencial de acción compuesto; para revertir este efecto, aumente progresivamente el voltaje. A medida que se reclutan más neuronas, la onda del potencial de acción compuesto aumenta de tamaño. Este ejercicio ilustra el hecho de que las neuronas individuales tienen diferentes umbrales a los cuales se desencadenan sus potenciales de acción.

Cuando un aumento adicional del voltaje de estimulación no incrementa la acción compuesta, significa que todos los neuronas han sido reclutados y deberían ser visibles dos picos distintos en la onda del potencial de acción en la pantalla del ordenador. La siguiente parte del experimento examina el período refractario de los axones. Cambie el retardo entre pulsos utilizando la pestaña en la esquina superior izquierda de la pantalla.

Continúe acortando el retardo hasta que no se pueda provocar el segundo potencial de acción compuesto. El período refractario absoluto se define como el retardo temporal entre pulsos en el que ya no se provoca un segundo potencial de acción. El período refractario relativo se define como el tiempo que transcurre desde el final del período refractario absoluto hasta el momento en que la aplicación de un segundo estímulo produce un segundo potencial de acción de amplitud completa.

Ahora puede investigar las propiedades de un inhibidor de uniones en hendidura como el heptanol. Las diferencias en el potencial de acción compuesto pueden compararse para los mismos ajustes de estimulación con el fin de determinar qué señales se conducen mediante uniones en hendidura a lo largo del cordón nervioso ventral. También podría utilizar solución salina fría o solución salina tibia y medir las diferencias en las velocidades de conducción de las distintas entidades que componen el potencial de acción compuesto.

Se muestran aquí dos potenciales de acción compuestos registrados del cordón nervioso ventral de un cangrejo de río. Esta figura ilustra el periodo refractario relativo, que es el tiempo posterior a un potencial de acción compuesto completo durante el cual un segundo estímulo provoca un potencial de acción compuesto menor. Esta figura muestra los efectos del uso de heptanol sobre el potencial de acción compuesto tras seguir este procedimiento.

Los componentes del circuito de membrana biológica pueden variarse para responder preguntas adicionales, como el efecto de una densidad alterada de canales de fuga en la membrana o la función de los canales activados por voltaje tras su desarrollo. Estas técnicas y procedimientos allanan el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología exploren cómo las células funcionan como circuitos eléctricos y cómo funcionan las uniones comunicantes en el tejido vivo de los animales.