Name: Determinación de la metilación del ADN de los genes impresos en Arabidopsis Endospermo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-28T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprende a determinar la metilación del ADN de genes impresos en endospermo de Arabidopsis mediante secuenciación de bisulfito. Este método permite analizar el estado epigenético de alelos maternos y paternos.

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Los autores agradecen a la Sra. Jennifer M. Lommel y Tara N. Rognan para el mantenimiento de plantas de Arabidopsis. Este trabajo fue apoyado por la puesta en marcha de fondos de la Universidad de Saint Louis y los Institutos Nacionales de Salud subvenciones 1R15GM086846-01 y 3R15GM086846-01S1 a W. Xiao.

I. genética Cruce 1. Castrando el progenitor femenino Con el fin de distinguir los alelos maternos y paternos mediante el uso de polimorfismo de secuencia de ADN, dos ecotipos diferentes, por ejemplo, Columbia-0 (Col-0) y Ler, será elegido como padres de familia femenino y masculino. Las plantas deben ser joven y saludable. Se puede castrar el progenitor femenino mediante el uso de un microscopio de disección, de aumento visor, o el ojo desnudo. Localizar 12 etapa flores (Smyth et al., 1990) y quitar cualquier flor o silicuas por encima y por debajo de ellos por el recorte de la base del pedúnculo con las tijeras. Esterilizar pinzas por inmersión de la base de la punta suavemente en un vaso de etanol al 95%, lo que eliminará los granos de polen en las pinzas y matar al polen también. Haciendo palanca con cuidado, aparte las yemas florales con unas pinzas y retire con cuidado 4 sépalos, pétalos 4, y 6 estambres, los pistilos dejando al descubierto e intacta. Trate de evitar el daño a los carpelos durante este proceso. 2. La elección del donante de polen y llevar a cabo la polinización Los donantes de polen son más anthesed flores se abren en la etapa 14, con los pétalos que se extiende en un ángulo de 90 ° para el pistilo (Smyth et al., 1990), en el que una gran cantidad de polen está derramando. Coge la flor en la base y justo por encima del pedúnculo, lo que hará que la flor de difusión abierta. Polvo el estigma del pistilo preparado con la antera. Después de la polinización, el estigma que serán cubiertos con el polen amarillo, que puede ser fácilmente observado bajo un microscopio. 3. Etiquetado de la cruz Después de la polinización todos los pistilos castrado en una planta, que marca la cruz con una etiqueta de la joyería y la información de los padres de ambos sexos y la fecha. Coloque una estaca en el suelo cerca de la planta, utilice una cadena para atar el tallo de la inflorescencia de la hoguera, y cubren los pistilos de polinización con una bolsa de plástico. II. El aislamiento de los tejidos del endospermo en Arabidopsis 1. Preparación de materiales Por lo general, obtener el material necesario listo antes de la cosecha del endospermo y los tejidos del embrión: un tanque de nitrógeno líquido, nitrógeno líquido, un microscopio de disección, dos nuevos pares de pinzas de punta fina (5 INOX FST por Dumont biología, Suiza.), Portaobjetos de vidrio ( 3 "x 1" x 1.0 mm), un pH de 5,7 solución de 0,3 M sorbitol y 5 mM MES. 2. Silicuas recolección A las 7 - y 8 días después de la polinización (DAP), las semillas están listas para ser cosechadas a mediados de la última etapa de torpedo de la embriogénesis y la disección de endospermo y el embrión. A veces, puede tardar 9-10 DAP si las flores están desvirtuadas demasiado joven. 3. Endospermo y el embrión de aislamiento Ya que las semillas de Arabidopsis son pequeños, se utiliza un microscopio de disección para aislar el endospermo y el embrión. Ponga una silicua 8-DAP con un microscopio, use un par de pinzas para sostener el pedicelo silicua y el uso de la punta del otro par de pinzas para abra la silicua en el margen donde se fusionan dos carpelos. Use un par de pinzas para recoger una semilla en soluciones de pH 5,7 de 0,3 M sorbitol y 5 mM MES, hacer un pequeño corte en el extremo micrópilo se deslice fuera del embrión, apriete el extremo sin cortar para expulsar el endospermo y el endosperma separado de cubierta de la semilla (Kinoshita et al., 2004). Puesto que el embrión y el endospermo en microtubos separado en nitrógeno líquido. Continúe hasta que se acumulan embrión o endospermo 10 a 15 silicuas y luego guarde el tubo en un congelador de -80 º C. En algunos casos, el endospermo no tiene que ser separado de cubierta de la semilla, es decir, se puede aislar el ARN total a partir del endospermo y la mezcla de cáscara de la semilla para el análisis de los genes la impronta. III. La secuenciación de bisulfito 1. Reactivos necesarios Bromuro de amonio cetiltrimetil (CTAB) para la preparación de ADN genómico, las enzimas de restricción, 3 M NaOH (recién hecho), 6,42 M de urea / 4 bisulfito de sodio M (2 metabisulfito de sodio M, Sigma-Aldrich, S9000, Na2S2O5, peso molecular: 190), 10 mM hidroquinona, un kit de purificación de ADN (Promega ADN Asistente de limpieza del sistema, cat. # A7280), tampón TE, 6,3 M NaOH (recién hecha), 10 M NH 4 OAc, 20 mg / l tRNA, y el 100% de etanol . 2. Los detalles del protocolo de tratamiento de bisulfito <ol><li> Aislar ADN genómico o del endospermo del embrión mediante un procedimiento de CTAB (Rogers y Bendich, 1988). </li><li> Recopilación de 100 ng - 2 mg de ADN genómico en 20 l de volumen de 100 l total con enzimas de restricción que cortan fuera de la región para ser analizados. Para el promotor de MEA, usamos XhoI, NdeI y PstI o HindIII. </li><li> Desnaturalizar las enzimas de restricción mediante la ebullición del ADN de cinco minutos y luego apagar el hielo. </li><li> Añadir un volumen 1 / 9 (2,2 l de 20 l de ADN digerido), de 3 M de NaOH y se incuba a 37 ° C durante 15 minutos. </li><li> Transferir la solución a un tubo de 250 l de PCR. </li><li> Disolver 7,5 g de urea en 10 ml de agua destilada estéril; Poco a poco añadir 7,6 g de metabisulfito de sodio durante 1-2 horas y la calefacción por lo general ayuda a la disolución, ajustar el pH a 5 con NaOH recién hecho 10 M, añadir agua destilada estéril a una final volumen de 20 ml. Se trata de 6,24 M de urea / 4 solución de sodio bisulfito M. </li><li> Añadir 6,24 M de urea / 4 M solución de bisulfito de sodio a una concentración final de 5,36 M y M 3,44, respectivamente (Paulin et al., 1998). Por ejemplo, añadir 208 l de 6,42 M de urea / 4 M solución de bisulfito de sodio a los anteriores 22,2 l de ADN genómico desnaturalizado (Xiao et al., 2003). </li><li> Añadir 10 mM hidroquinona al ADN a una concentración final de 0,5 mM (12 l para la digestión 20 l). </li><li> Realizar el tratamiento de bisulfito en una máquina de PCR: 30 ciclos de 55 ° C durante 15 minutos y los segundos 95 ° C durante 30. </li><li> Desalar el ADN bisulfito tratados con el ADN Asistente de Limpieza del sistema de Promega y el seguimiento del protocolo (Jacobsen et al., 2000). </li><li> Medir el volumen exacto de TE se recuperó de la columna después de la desalación y añadir 6,3 M de NaOH a una concentración final de 0,3 M. Se incuba a 37 ° C durante 15 minutos. </li><li> Añadir 10 M NH 4 OAc (pH 7,0) a una concentración final de 3 M, 2 l de 20 ug / l tRNA, y 3 volúmenes de etanol al 100% y luego mezclar. Centrifugar durante 15 minutos a 14.000 rpm. </li><li> Lavar el sedimento una vez con etanol al 70%, hacer un centrifugado corto, y retirar el etanol extra. </li><li> Seco en pelets en un speedvac durante 5-10 minutos y resuspender en 25 hasta 100 l de buffer TE en función de la cantidad de ADN de partida. El bisulfito sódico tratados con ADN está listo para el análisis de PCR. </li></ol> 3. Amplificación por PCR <ol><li> Desde citosinas no metiladas se convierten en uracilo, es difícil para amplificar un fragmento de gran tamaño utilizando el ADN tratado con bisulfito como una plantilla. Por lo tanto, suelen diseñar primers para amplificar un producto de no más de 500 pb. Para la secuencia del promotor de 4 kb MEA, hemos diseñado varios conjuntos de cebadores y la superposición de fragmentos amplificados 14 para cubrir toda la región (Xiao et al., 2003). </li><li> A la secuencia de la parte superior de hebra, en el diseño de una cartilla con interés, I) elegir una G (guanina)-rica región con el fin de tener una temperatura más alta de recocido sin nucleótidos de largo adicionales en las cartillas, II) el cambio C (citosina) a Y ( pirimidina) en el CG y los contextos de GNC y cambiar el resto de C a T (timina). En el diseño de un cebador inverso, I) elija una región rica en C, II) el cambio de G R (purina) en CG y los contextos de GNC y cambiar el resto de G a A (adenina). </li><li> A la secuencia de la parte inferior-cadena, en el diseño de una cartilla con interés, I) elija una región rica en C, II) el cambio G a R en CG y los contextos de GNC y el cambio del G restantes a A. En el diseño de un cebador inverso, I) elegir una región rica en G; II) El cambio C a Y (pirimidina) en el CG y los contextos de GNC y cambiar el resto de C para T. </li><li> Por lo general, el uso 1.2 l de sodio bisulfito tratados con ADN como una plantilla para cada amplificación por PCR (Xiao et al., 2003). El producto de PCR debe ser analizado por electroforesis en gel para confirmar el tamaño correcto del fragmento, luego de ser gel purificado y clonado en el vector TOPO TA clonación pCR2.1 (Invitrogen) como una inserción. Una sola colonia se recoge y se cultivan; ADN plásmido extraído y enviado para su secuenciación. </li></ol> 4. Análisis de secuencias El principio de la secuenciación de bisulfito es que la citosina no metilados se convertirá en uracilo debido a la desaminación hidrolítica por la alta concentración de bisulfito de sodio a pH 5,0, que se amplifica a medida que la timina en el producto de PCR, mientras que el 5-metil citosina no será modificado por bisulfito de sodio y aún no se han citosina después de la amplificación por PCR (Clark et al, 1994;. Frommer et al, 1992).. Después de obtener el resultado de la secuencia, se la compara con la plantilla capítulo específico que se utiliza para la amplificación por PCR. Si un residuo de citosina en la plantilla se lee como una timina en el resultado de la secuencia, indica que la citosina no está metilado. Si un residuo de citosina en la plantilla sigue siendo una citosina en la secuencia, significa que la citosina está metilado. IV. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2327/2327fig1.jpg" alt="Figura 1 /" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1 /"> Figura 1.

<ol><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li>
<li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li>
<li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li>
<li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+hypermethylation+of+flower-specific+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).</li>
<li>Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-way+control+of+FWA+imprinting+in+Arabidopsis+endosperm+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation.</a> Science. 303, 521-523 (2004).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462, 315-322 (2009).</li>
<li>Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+improves+efficiency+of+bisulfite-mediated+sequencing+of+5%27-+methylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA.</a> Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).</li>
<li>Rogers, S. O., &amp, B. endich, J, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Manual%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from plant tissues.</a> Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Flower+Development+in+Arab%C3%ADdopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early Flower Development in Arabídopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li>
</ol>

Es relativamente fácil de separar del embrión y endospermo cubierta de la semilla, pero es tedioso para separar el endospermo de la cáscara de la semilla, especialmente para las semillas en la etapa de principios o mediados de torpedo de la embriogénesis. Desde cubierta de la semilla sólo aporta una pequeña cantidad de tejido, para algunos genes, por ejemplo, MEA y FWA, no hay que separar el endospermo de la cáscara de la semilla. Esto significa que podemos aislar ARN a partir de una mezcla de endosper...

Suministros <ul><li> Microscopio de disección </li><li> Tijeras </li><li> Pinzas de punta fina </li><li> Joyas de la etiqueta </li><li> Las estacas de plantas </li><li> Cuerdas o cintas de cierre </li><li> 4 &quot;X 2&quot; X 8 &quot;Bolsas de Polietileno </li><li> 3 &quot;x 1&quot; x 1.0 mm Micropreparados </li><li> El nitrógeno líquido </li><li> Los contenedores de nitrógeno líquido </li><li> Bloquear el calor </li><li> Tubos para PCR </li><li> Termociclador </li><li> Tubos de microcentrífuga </li><li> Microcentrífuga </li><li> Gel de electroforesis de instalación </li><li> Arabidopsis thaliana Columbia-0 plantas </li><li> Arabidopsis thaliana Landsberg erecta plantas </li></ul> Reactivos <ul><li> 70% de etanol </li><li> Etanol al 95% </li><li> 100% de etanol </li><li> 0,3 M sorbitol y 5 mM MES, pH 5,7 </li><li> Bromuro de amonio cetiltrimetil (CTAB) </li><li> 100% de etanol </li><li> Cholorform </li><li> Las enzimas de restricción </li><li> 3 M NaOH </li><li> 6,3 M NaOH </li><li> 6,24 M de urea / 4 bisulfito de sodio M </li><li> Destilada estéril H 2 O </li><li> 10 mM hidroquinona </li><li> Asistente de ADN Clean-Up System (Promega) </li><li> 10 M NH 4 OAc </li><li> 20 mg / l tRNA </li><li> Tampón TE </li><li> El kit de clonación TOPO TA (Invitrogen) </li></ul>

determinación de la metilación del adn de los genes impresos en arabidopsis endospermo

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana es un organismo modelo excelente para estudiar los mecanismos epigenéticos. Una de las razones es el mutante nulo de pérdida de función de ADN metiltransferasa es viable, proporcionando así un sistema para estudiar cómo la pérdida de metilación del ADN en el genoma afecta el crecimiento y desarrollo. La impronta se refiere a la expresión diferencial de los alelos maternos y paternos, y juega un papel importante en el desarrollo de la reproducción, tanto en mamíferos y plantas. Metilación del ADN es fundamental para determinar si los alelos maternos y paternos de un gen impreso se expresa o se silencian. En las plantas con flores, hay un evento de doble fertilización en la reproducción: un espermatozoide fertiliza el óvulo para formar un embrión y el espermatozoide se fusiona con la célula de segundo central para dar lugar a endospermo. Endospermo es el tejido donde se produce en las plantas de impresión. MEDEA, un dominio establecido Polycomb gen del grupo, y la FWA, un factor de transcripción que regulan la floración, son los dos primeros genes demostrado ser impreso en el endospermo y su expresión está controlada por la metilación del ADN y desmetilación en las plantas. Con el fin de determinar el estado de impresión de un gen y el patrón de metilación en el endospermo, tenemos que ser capaces de aislar primero endospermo. Desde la semilla es muy pequeña en Arabidopsis, que sigue siendo un reto para aislar endospermo Arabidopsis y examinar su metilación. En este protocolo de vídeo, se presenta la manera de realizar un cruce genético, para aislar el tejido del endospermo de las semillas, y para determinar el estado de metilación de la secuenciación de bisulfito.

La impresión es un fenómeno en la planta y reproducción de los mamíferos. Metilación del ADN juega un papel importante en los mecanismos de impresión. Aislar endospermo y determinar el estado de metilación de los genes impresos en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Puede ser difícil. En este protocolo, se describe cómo aislar endospermo y determinar la metilación de la secuenciación de bisulfito.

Determinación de la metilación del ADN de los genes impresos en Arabidopsis Endospermo

Arabidopsis thaliana es un organismo modelo excelente para estudiar los mecanismos epigenéticos. Una de las razones es el mutante nulo con pérdida de función de ADN...

El objetivo general de este procedimiento es determinar el estado de metilación del ADN en genes impresos en el endospermo. Esto se logra primero mediante la emasculación del progenitor hembra. Luego, el progenitor hembra se poliniza con el polen del progenitor macho.A continuación, se disecciona el endospermo del óvulo fecundado mediante polinización cruzada. El paso final del procedimiento consiste en realizar la secuenciación con bisulfito del ADN del endospermo. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran el estado de metilación del ADN del alelo materno o paterno de un gen impreso mediante polimorfismo de secuenciación del ADN en diferentes ecotipos y secuenciación con bisulfito.Hola, soy la doctora Yang Shaw del Departamento de Biología de la Universidad de St. Louis. Hola, soy Matthew Ray del laboratorio del doctor J y del Departamento de Biología de la Universidad de St. Louis. Soy Diman Panu del laboratorio del doctor J.Hoy les mostraremos un procedimiento para diseccionar un oficiante de rugby y determinar el estado de metilación del ADN mediante secuenciación por sulfito. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la impronta génica regulada por metilación y desmetilación del ADN. Así que comencemos.Para comenzar este procedimiento, seleccione dos ecotipos diferentes de Arabidopsis para utilizarlos como progenitores femenino y masculino, con el fin de distinguir los alelos maternos y paternos mediante el polimorfismo de secuencias de ADN. Aquí, Columbia cero y Landsberg Erecta se eligen como progenitores femenino y masculino, respectivamente. Tenga cuidado de seleccionar plantas jóvenes y sanas.Emascula el progenitor hembra con la ayuda de un microscopio estereoscópico. Localiza flores en el estadio 12 y elimina cualquier flor o capullos inmaduros (LICs) por encima y por debajo cortando la base del pedúnculo con tijeras. Esteriliza la pinza sumergiendo suavemente la base de la punta en un vaso de precipitados con etanol al 95%.Esto eliminará cualquier grano de polen presente en la pinza y matará al polen. Abra suavemente los capullos florales usando la pinza y retire cuidadosamente cuatro sépalos, cuatro pétalos y seis estambres, dejando el pistilo descubierto e intacto. Trate de evitar dañar los carpelos durante este proceso.El siguiente paso consiste en seleccionar el donante de polen y realizar la polinización. Los mejores donantes de polen son las flores abiertas en la etapa 14, con los pétalos extendidos en un ángulo de 90 grados respecto al pistilo, en las que se está liberando una gran cantidad de polen. Sujete la flor por la base y justo por encima del pedicelo, lo que hará que la flor se abra y libere polvo. El estigma del pistilo preparado con la antera.Después de la polinización, el estigma quedará cubierto con polen amarillo, lo cual puede observarse fácilmente bajo un microscopio. Después de polinizar todos los pistilos emasculados en una planta, etiquétela con una etiqueta de joyería indicando el cruce. Incluya la fecha y la información sobre los progenitores hembra y macho.Coloque una estaca en el suelo cerca de la planta. Use un hilo para atar el tallo del individuo en fluorescencia a la estaca y cubra los estigmas polinizados con una bolsa de plástico. A los siete u ocho días después de la polinización o DAP, la semilla debería estar lista para ser cosechada en la etapa media o tardía de embriogénesis en forma de torpedo y disecada.Para el endospermo y el embrión, coloque un salic de ocho DAP bajo el microscopio estereoscópico. Con un par de pinzas, sostenga la célula EK P y use la punta de otro par de pinzas para abrir suavemente la suela en el margen donde se fusionan los dos carpelos. Utilice un par de BPS para recoger una semilla y colóquela sobre un portaobjetos de vidrio.Luego, haga un corte pequeño en el extremo del microtubo para extraer el embrión. Presione el extremo sin corte para expulsar el endospermo y sepárelo de la cubierta seminal. A continuación, coloque el embrión y el endospermo en microtubos separados y en nitrógeno líquido.Continúe este proceso hasta acumular suficiente embrión o endospermo de 10 a 15 CLIC. Luego, almacene los tubos en un congelador a menos 80 grados Celsius antes del tratamiento con bisulfito. Aísle el ADN genómico del endospermo o del embrión utilizando un procedimiento sutil de bromuro de trimetil amonio o CTAB.Una vez que se ha aislado el ADN genómico del endospermo, digiera 100 nanogramos en una reacción con un volumen total de 20 microlitros con enzimas de restricción que corten fuera de la región que se va a analizar. Para el promotor ME, se utilizan las enzimas de restricción Xho, O1N1 y PST1. Desnaturalice las enzimas de restricción hirviendo el ADN durante cinco minutos.Luego, detenga la reacción en hielo. Añada un noveno volumen o 2,2 microlitros de hidróxido de sodio tres molar y incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Tras la incubación, transfiera la solución a un tubo PCR de 250 microlitros.A continuación, prepare una solución de urea 6,24 molar y sulfito de sodio 4 molar disolviendo 7,5 gramos de urea en 10 mililitros de agua destilada estéril, añadiendo lentamente 7,6 gramos de sulfito metabisulfito de sodio durante una a dos horas mientras se calienta y agita la solución. Una vez disuelto, ajuste el pH a cinco con hidróxido de sodio 10 molar recién preparado.Añada agua destilada estéril hasta un volumen final de 20 mililitros. Transfiera 208 microlitros de esta solución a 22,2 microlitros de ADN genómico de endospermo desnaturalizado. Luego añada 12 microlitros de hidroquinona recién preparada 10 milimolar al ADN.Realice el tratamiento con bisulfito en una máquina de PCR con 30 ciclos de 15 minutos a 55 grados Celsius, seguidos de 30 segundos a 95 grados Celsius. A continuación, desaline el ADN tratado con bisulfito utilizando el sistema de purificación de ADN Wizard de Promega. Según las instrucciones del fabricante, mida el volumen exacto de TE recuperado de la columna tras la desalación.Luego, agregue hidróxido de sodio 6,3 molar hasta una concentración final de 0,3 molar. Incube la mezcla a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Tras la incubación, agregue acetato de amonio 10 molar hasta una concentración final de tres molar, dos microlitros de ARNt a 20 microgramos por microlitro y tres volúmenes de etanol al 100 %.Mezcle la muestra y centrifugue durante 15 minutos a 14.000 RPM. Lave el sedimento una vez con etanol al 70 %, seguido de una breve centrifugación para eliminar el etanol sobrante. Finalmente, seque el sedimento en un evaporador de velocidad durante cinco minutos y reconstitúyalo en 25 microlitros de tampón TE.El ADN tratado con bisulfito de sodio ya está listo para el análisis mediante PCR. Para secuenciar el promotor de cuatro kilobases de Madea, diseñe varios conjuntos de cebadores y amplifique 14 fragmentos solapados para cubrir toda la región. Comience diseñando un cebador directo para secuenciar la cadena superior.Primero, elija una región rica en guanina para obtener una temperatura de hibridación más alta sin necesidad de nucleótidos excesivamente largos en los cebadores. A continuación, cambie la citosina por timina en los contextos CG y CNG. Luego, cambie cualquier otra citosina por timina.Al diseñar un cebador inverso, elija una región rica en citosina. Cambie la guanina a purina en los contextos CG y CNG, y cualquier otra guanina a adenina. Para secuenciar nuevamente la cadena inferior, comience por diseñar un cebador directo.Seleccione una región rica en citosina y cambie la guanina por purina en los contextos CG y CNG. Cambie las demás guaninas por adenina. Al diseñar la pareja inversa, elija una región rica en AINE.Cambie la citosina por uracilo en los contextos CG y CNG y cambie las citosinas restantes por timina. Una vez diseñados los cebadores, prepare una reacción de PCR utilizando dos microlitros del ADN tratado con bisulfito de sodio como molde para cada amplificación por PCR. Realice la reacción de PCR y analice el producto mediante electroforesis en gel para confirmar el tamaño correcto del fragmento.Siguiente gel. Purifique el producto de PCR y clónelo en el vector de clonación topo TA de invitrogen PCR 2.1. Como inserto, secuencie clones individuales; el principio de la secuenciación con bisulfito es que la citosina no metilada se convertirá en uracilo debido a la desaminación hidrolítica provocada por una alta concentración de bisulfito de sodio a pH 5,0.Por el contrario, la citosina metilada no será modificada por el sulfito de sodio. La uracilo será amplificada como timina en el producto de PCR, mientras que la citosina metilada permanecerá como citosina tras la amplificación por PCR. Después de obtener el resultado de secuenciación, compárelo con la plantilla específica de la cadena que se utilizó para la amplificación por PCR.Si un residuo de citosina en la plantilla se lee como una timina en el resultado del secuenciamiento, indica que la citosina no está metilada. Si un residuo de citosina en la plantilla permanece como citosina en el resultado del secuenciamiento, significa que la citosina está metilada. El estado de metilación del alelo materno de MEA en la región de menos 500 pares de bases del promotor de MEA para cinco sitios CpG metilados en los clones secuenciados de Columbia, g Clarus cruzado con endospermo de RLD se muestra; las citosinas metiladas se indican mediante círculos negros rellenos y las citosinas no metiladas mediante círculos blancos sin relleno. De manera similar, se muestra el estado de metilación para el alelo materno de Madea de Columbia, Gladys cruzado con embrión de RLD.Acabamos de mostrarle cómo aislar el endospermo y realizar la secuenciación por sulfito al llevar a cabo este procedimiento. Es importante recordar seguir el protocolo correctamente. Eso es todo.Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.

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