Name: La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprende a producir transgenes en C. elegans mediante recombinería con el marcador GAL K. Este método conserva los elementos reguladores nativos del ADN genómico para modificaciones genéticas precisas.

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Los autores desean agradecer a Lindsey Nash en busca de ayuda con el desarrollo de la técnica. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención AG028977 a ALF, una subvención para el proyecto piloto de la Universidad de Pittsburgh OAIC (AG024827), y los fondos de las semillas de la Universidad de Pittsburgh.

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<li>Snow, M. I., Larsen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+daf-12%3A+a+nuclear+hormone+receptor+with+three+isoforms+that+are+involved+in+development+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).</li>
<li>Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+K10C2.4+Gene+Encodes+a+Member+of+the+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Family.+A+CAENORHABDITIS+ELEGANS+MODEL+OF+TYPE+I+TYROSINEMIA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA.</a> J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).</li>
<li>Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+of+the+heterochronic+gene+lin-14+by+lin-4+mediates+temporal+pattern+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans.</a> Cell. 75, 855-862 (1993).</li>
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<li>Bamps, S., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+expression+pattern+analysis%2C+in+situ%2C+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Brief.+Funct.+Genomic.+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans.</a> Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).</li>
<li>Dolphin, C. T., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+reporter+fusion+genes+generated+by+seamless+modification+of+large+genomic+DNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones.</a> Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).</li>
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<li>Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+using+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering using homologous recombination.</a> Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).</li>
<li>Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+MW005%3A+lambda+Red-mediated+recombineering+and+copy-number+induction+of+oriV-equipped+constructs+in+a+single+host%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host.</a> BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).</li>
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<li>Penfold, R. J., Pemberton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+suicide+vector+for+construction+of+chromosomal+insertion+mutations+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria.</a> Gene. 118, 145-146 (1992).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-3+mediates+the+initial+clustering+and+apical+localization+of+junction+and+polarity+proteins+during+C.+elegans+intestinal+epithelial+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization.</a> Development. 137, 1833-1842 (2010).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+cloning+of+unc-119%2C+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li>
</ol>

La generación de los transgenes de fosmids ofrece la ventaja de conservar todos los elementos promotor nativo, las variantes de empalme, y 3 &#39;UTR elementos reguladores. Esto puede conducir a la construcción de un transgén que es más un reflejo de los patrones de expresión nativa, o la construcción de un transgén funcional cuando otros métodos fallan 5. Los transgenes resultante puede llevar a una variedad de etiquetas epítopo incluyendo GFP o una etiqueta de TAP. La construcci...

<table><tbody><tr><td>Kit FosmidMAX</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FMAX046</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Medio MOPS</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2120</td><td></td></tr><tr><td>Solución de fosfato de potasio 0,132 M</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2102</td><td></td></tr><tr><td>D-galactosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>2-desoxigalactosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4407</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Polimerasa Phusion de ADN</td><td>New England Biolabs</td><td>F-530S</td><td></td></tr><tr><td>Base de agar MacConkey</td><td>BD Biosciences</td><td>281810</td><td></td></tr><tr><td>Arafinosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3131</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr></tbody></table>

la producción de c. elegans los transgenes a través de recombinería con la galk marcador seleccionable

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

La creación de animales transgénicos se utiliza ampliamente en C. elegans de investigación, incluyendo el uso de proteínas de fusión GFP para estudiar la regulación y el patrón de expresión de genes de interés o de generación de purificación por afinidad en tándem (TAP) etiquetados versiones de genes específicos para facilitar su purificación. Normalmente, los transgénicos son generados por la colocación de un promotor aguas arriba de un gen reportero GFP o cDNA de interés, y esto a menudo produce un patrón de expresión representativa. Sin embargo, los elementos críticos de la regulación génica, tales como elementos de control en la región 3 &#39;no traducida o promotores alternativos, podría perderse por este enfoque. Además sólo una variante de empalme solo puede ser estudiado por lo general por este medio. En contraste, el uso del ADN del gusano genómico realizado por clones de ADN fosmid probablemente incluye a la mayoría si no todos los elementos que intervienen en la regulación génica in vivo que permite la mayor capacidad de capturar el patrón de expresión genuina y el calendario. Para facilitar la generación de transgenes utilizando ADN fosmid, se describe una E. coli procedimiento basado en recombinería para insertar las buenas prácticas agrarias, un TAP-tag, u otras secuencias de interés en cualquier lugar en el gen. El procedimiento utiliza el gen GALK como el marcador de selección, tanto para los pasos de selección positiva y negativa en recombinería lo que se traduce en la obtención de la modificación deseada con gran eficiencia. Además, los plásmidos que contienen el gen GALK flanqueado por los brazos de homología con las buenas prácticas agrarias de uso común y TAP genes de fusión están disponibles que reducen el costo de oligos en un 50% cuando se genera una proteína de fusión GFP o TAP. Estos plásmidos utilizar el origen de replicación R6K que se opone a la necesidad de purificación extensa producto de la PCR. Por último, también demuestra una técnica para integrar el marcador unc-119 a la columna vertebral fosmid que permite que el fosmid que se inyecta directamente o bombardeados en gusanos para generar animales transgénicos. Este video muestra los procedimientos involucrados en la generación de un transgén por recombinería usando este método.

La capacidad de producir transgenes de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Utilizando ADN genómico realizado por fosmids es particularmente atractivo ya que todos los elementos de regulación nativos se mantienen. Descrito es un procedimiento sencillo y robusto para la producción de transgenes a través de recombinería con la<em&gt; GALK</em&gt; Marcador de selección.

La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable

La creación de animales transgénicos se utiliza ampliamente en la investigación con C. elegans, incluyendo el uso de proteínas de fusión con GFP para estudiar la regulación y...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en generar transgenes utilizando ADN genómico de gusano contenido en un clon de biblioteca SMID. El uso de ADN genómico conserva todos los elementos reguladores nativos, como los potenciadores en las regiones UTR tres primas. Esto se logra trasladando el SMID FO a la cepa de E. coli SW106 para aprovechar la maquinaria inducible de recombinación lambda red.Como segundo paso, el gen GAL K se inserta en la ubicación deseada en el FO smid, lo que marca el sitio donde se colocará la GFP o la etiqueta tap. A continuación, el gen Gade se reemplaza por GFP o una etiqueta TAC mediante recombinación homóloga, seguido de una selección negativa utilizando galactosa desoxi con el fin de crear el transgén modificado. Se obtienen resultados que demuestran que estos transgenes pueden generarse rápida y exitosamente, basándose en la verificación de la inserción de T mediante PCR de colonias.Hola, me llamo Love Ship. Trabajo en el Laboratorio Fisher de la Universidad de Pittsburgh. Hoy estoy demostrando la técnica para crear un transgén en C. elegans.Por qué recombinar con GK como marcador seleccionable. La principal ventaja de esta técnica fren

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Este video muestra la técnica de microinyección en la gónada de C. elegans para crear animales transgénicos.

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RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

Sistemáticos ya gran escala sintéticos genéticos (gen-gen o epistasis) pantallas de interacción puede ser utilizado para explorar la redundancia genética y la vía de la diafonía. A continuación, se describe un alto rendimiento cuantitativo sintético tecnología de detección genética amplia, denominada eSGA que hemos desarrollado para la aclaración de las relaciones y explorar epistatic interacción en redes...

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Este protocolo describe un procedimiento rápido y de bajo consumo de material para la integración de matrices extracromosómicas transgénicas en el genoma de Caenorhabditis elegans utilizando irradiación ultravioleta (UV). Además, este protocolo es particularmente adecuado para líneas transgénicas que transmiten matrices extracromosómicas a una alta velocidad.

Un protocolo rápido para la integración de matrices extracromosómicas con alta tasa de transmisión en el genoma de C. elegans

Las proteínas a menudo contienen varios dominios que pueden ejercer diferentes funciones celulares. Genes knock-out (KO) no tienen en cuenta esta diversidad funcional. Aquí, se presenta un enfoque basado en la estructura-función de intercambio de casete de recombinación mediada (RMCE) en células madre embrionarias de KO que permite la disección molecular de varios dominios funcionales o variantes de una proteína.

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