Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 1:30 min. • March 4th, 2025
Comience con las proteínas del LCR, incluida la alfa-sinucleína fosforilada, un biomarcador de enfermedades neurodegenerativas.
Agregue un tampón de carga que contenga un detergente, un agente reductor y un tinte de seguimiento.
Caliente para desnaturalizar las proteínas, luego cárguelas en un gel SDS-PAGE.
Realizar electroforesis para separar las proteínas por peso molecular en bandas distintas.
Incubar el gel en un tampón secante con agitación.
A continuación, electrotransfiere las bandas de proteínas del gel a la membrana.
Trate la membrana con un fijador para retener la proteína en la membrana, luego lave.
Incubar con una solución bloqueante que contenga anticuerpos primarios e inhibidores de la fosfatasa para mantener la fosforilación de la alfa-sinucleína.
Los anticuerpos interactúan exclusivamente con la alfa-sinucleína fosforilada y los reactivos bloqueantes bloquean los sitios de interacción inespecíficos y luego se lavan.
Introducir anticuerpos secundarios conjugados con enzimas que interactúan con los anticuerpos primarios y, a continuación, lavar.
Añade un sustrato quimioluminiscente, interactuando con las enzimas y generando una quimioluminiscencia.
Una banda quimioluminiscente confirma la presencia de alfa-sinucleína fosforilada.