Detección de agregados de proteínas priónicas mal plegadas en tejido cerebral de ratón mediante Western Blotting

Tome un homogeneizado de tejido del cerebro de un mamífero que contiene tanto proteínas priónicas normales como agregados de priones mal plegados responsables de enfermedades neurodegenerativas.

Incubar con una enzima proteolítica para digerir los priones normales, dejando intactos los agregados resistentes.

Trate los agregados con un tampón desnaturalizante a alta temperatura para linealizar las proteínas e impartir una carga negativa uniforme.

Cargue la muestra en un gel de electroforesis y separe las proteínas en bandas, lo que confirma la presencia de agregados.

Usando un campo eléctrico, transfiera las proteínas separadas a una membrana.

Incubar la membrana en una solución de bloqueo para enmascarar los sitios de unión no específicos.

Incubar con anticuerpos marcados con la enzima peroxidasa, que se unen específicamente a los agregados de priones.

Lave la membrana para eliminar los anticuerpos no unidos, minimizando las señales inespecíficas.

Agregue un sustrato quimioluminiscente y un agente oxidante, permitiendo que la peroxidasa oxide el sustrato y produzca luz.

Mida la intensidad de la luz para cuantificar los priones mal plegados en el homogeneizado.