JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 1:22 min • March 4th, 2025
Comience con un tejido cerebral humano en un tampón de lisis.
Homogeneizar el tejido con un homogeneizador para liberar proteínas, incluida la ácido glutámico descarboxilasa, o isoformas de la enzima GAD, esenciales para la función cerebral.
Incubar el homogeneizado en hielo, luego centrifugar para pellet los desechos. Recoge el sobrenadante que contiene proteína.
Agregue un tampón de carga que contenga un detergente y un agente reductor para desnaturalizar las proteínas.
Cargue esta muestra y un marcador molecular en un gel SDS-PAGE de gradiente y electroforese para separar las proteínas en bandas distintas.
Electroseca las proteínas del gel en una lámina de membrana.
Agregue un agente de bloqueo para evitar el enlace no específico.
Incubar con anticuerpos primarios específicos de la isoforma GAD que se unen a sus isoformas receptivas de GAD.
Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.
Incubar con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia.
Lavar de nuevo y visualizar las bandas de proteínas en un sistema de imágenes.
Detecte las bandas de GAD a través de fluorescencia y confirme sus diferencias de peso molecular utilizando el marcador.