Name: De células enteras de grabación de calcio activados por calcio de lanzamiento (CRAC) Las corrientes en los linfocitos T humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Aprende a registrar corrientes CRAC en linfocitos T humanos mediante la técnica de patch clamp de célula entera. Este método permite medir de forma fiable la actividad de canales de calcio para estudiar la función inmunitaria.

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Estamos agradecidos con el Departamento de Fisiología y Biología de Membrana de la Universidad de California Davis para que nos proporciona las instalaciones y un excelente ambiente para los estudios de los canales iónicos.

1. Preparación de los linfocitos T en reposo Humanos <ol><li> Utilizando RosetteSep Humanos Cocktail de enriquecimiento de células T y de densidad media RosetteSep, purificar las células T de muestras de sangre humana de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La población de células resultante debe contener un 95% CD3 + células T en reposo. Purificamos linfocitos T humanos de sangre periférica recogida de voluntarios sanos, de acuerdo con el protocolo aprobado por el Consejo de la Universidad de California Davis Revisión Interna. </li><li> Tras el aislamiento, volver a suspender las células T en reposo, con una densidad de 0,5 x 10 6 células / ml en medio de cultivo celular que contiene medio RPMI-1640 con glutamina y HEPES, complementado con un 10% de suero fetal bovino, 2% Glutamax-I, 1% de RPMI 1640 vitamina solución, una solución de RPMI 1640% aminoácidos, 1% de piruvato de sodio, y el 0,03% β-mercaptoetanol. </li><li> Lugar la suspensión de células en frascos de cultivo celular y mantener a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% de CO 2 durante un máximo de 24 horas antes del experimento. </li></ol> 2. Preparación de la Cámara de grabación <ol><li> Los siguientes son necesarios para preparar las cámaras de grabación: a) el silicio O-rings, b) redondo, 25 mm cubreobjetos limpian con 70% de etanol y H 2 O destilada, c) las mezclas Sylgard184, preparados de acuerdo con las instrucciones del fabricante, yd) dos de 60 x 15 mm Petri. </li><li> Lugar ~ 0,5 ml de la mezcla en un plato Sylgard184 60x15 mm-Petri. </li><li> Sumerja la parte inferior de la junta tórica en la pinza Sylgard184 utilizando. </li><li> Eliminar el exceso de Sylgard184 desde el borde del anillo mediante la colocación de la junta tórica en una superficie limpia, como la otra placa de Petri. </li><li> Coloque el anillo en el cubreobjetos y se presiona. </li><li> Curar la Sylgard184 por las cámaras de calefacción a 85 ° C durante 40-60 minutos o hasta que el Sylgard184 se polimeriza. </li><li> Tienda de las cámaras de grabación en un recipiente de polvo. </li></ol> 3. Preparación de pipetas de parches <ol><li> En el día del experimento, tire pipetas con un diámetro de la punta ~ 2 micras utilizando capilares de vidrio y un extractor de la pipeta. Usamos tubos de borosilicato con filamento (OD: 1.5 mm y ID: 1,10 mm). Pipetas guárdela en un lugar libre de polvo. </li><li> Escudo puntas de pipeta con Sylgard184 o HIPEC revestimiento Semiconductor R6101 de protección, de acuerdo con un procedimiento estándar de 9. </li><li> Suavemente el fuego pulido las pipetas antes del experimento. </li></ol> 4. Preparación de la instalación de patch clamp <ol><li> Configurar y guardar las macros para la formación de gigaseal en el software que controla el amplificador de patch-clamp. Utilizamos un amplificador EPC-10 compatible con Windows XP y el software de pulso para la adquisición de datos. Hemos creado el "set-up", "en las células", y "conjunto de células" macros de acuerdo con el manual de EPC-10 y los utilizan para todos los experimentos. </li><li> Preparar soluciones para baños y soluciones de la pipeta en la Tabla 1 antes del experimento y almacenarlas a 4 º C durante un máximo de 1 semana. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Productos químicos </td><td colspan="3"> Soluciones de Bath (mM) </td><td> Pipeta Solutions (mM) </td></tr><tr><td></td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td><td></td></tr></tbody><tbody><tr><td> CH 3 SO 3 Na </td><td> 130 </td><td> 110 </td><td> 125 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> - </td></tr><tr><td> Ca (OH) 2 </td><td> - </td><td> 20 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> HEDTA </td><td> - </td><td></td><td> 10 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> CS-Aspartate </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 125 </td></tr><tr><td> BAPTA </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Soluciones para el conjunto de células grabaciones actuales CARC. Todos los productos químicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. <ol start="3"><li> Determinar los potenciales de unión líquida (LJ) entre la solución de parche pipeta y cada solución del baño 10. Guardar el valor LJ en el lugar adecuado con el software de adquisición. Por ejemplo, en el programa Pulso insertar el valor en LJ "LJ" control en el "amplificador" de la ventana. </li><li> Configurar y guardar los protocolos de estimulación, como se muestra en la Figura 1, en el lugar apropiado de su software de adquisición antes de los experimentos. En el programa Pulso, se establece el protocolo de adquisición en la "Generación de pulso" de la ventana. <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. . Protocolo de estimulación Rampa de tensión -120 a 100 mV de 50 ms de duración se aplica cada 0,2 a 2 s (5 a 0,5 Hz). Potencial de mantenimiento (V h) entre las rampas se mantiene en 30 mV. </li></ol> 5. Las células de montaje de la platina del microscopio <ol><li> Abrigo de las cámaras de grabación con poli-L-lisina de aproximadamente 20 minutos y lavar con H 2 O y luego con solución salina balanceada de Hank (HBSS) de las placas, las células. </li><li> Placa de 500 l de suspensión celular que contiene 0,2-0,5 x 10 6 células en la cámara y se incuba durante 20 min a 37 ° C. </li><li> Asegure la cámara de registro con las células colocadas en un soporte de cámara. Utilizamos un soporte de cámara a medida, donde la base soporta la parte inferior del cubreobjetos, mientras que la parte superior presiona suavemente contra la parte superior del cubreobjetos. </li><li> Coloque el soporte de la cámara en la platina del microscopio invertido. </li><li> Centrarse en las células de la luz transmitida. Nosotros usamos un objetivo de inmersión 40X. </li><li> Coloque el electrodo de referencia Ag / AgCl en el baño. </li><li> Alinear la multibarrel, impulsado por la gravedad del sistema de perfusión. La punta del tubo de entrada debe ser colocado en un ángulo de 45 ° hasta el fin cubreobjetos para el campo de visión. </li><li> Coloque el tubo de aspiración frente a la punta del tubo de entrada. </li><li> Perfusión de la cámara con tampón fosfato salino (PBS) o HBSS para lavar los medios de cultivo celular y las células unen libremente. </li></ol> 6. CRAC Canal Corrientes grabación <ol><li> Encontrar una célula que se une firmemente a la cubreobjetos. Por lo general selecciona uno de tamaño medio, de células redondas, con una superficie exterior lisa. </li><li> Perfusión de la cámara de grabación con Ca 2 + libre, 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 (Tabla 1) que contiene 0.5-1 thapsigargin M durante 8-10 minutos para bloquear la bomba SERCA. Llevamos a cabo este paso al agotamiento de la tienda antes de la formación gigaseal. </li><li> El uso de un microloader Eppendorf y un P-20 pipeta de desplazamiento, llenar el parche pipeta con la solución de la pipeta (Tabla 1) e insertar el parche pipeta en el soporte de la pipeta en el headstage amplificador. El Ca 2 + quelante BAPTA está incluido en la solución de la pipeta a agotar pasivamente la tienda y para reducir el Ca 2 +-dependiente de inactivación del canal CRAC. </li><li> Aplique una pequeña cantidad de presión positiva (~ 3 cm de H 2 O) en el interior de la pipeta parche antes de entrar en el baño. Usamos una medida de presión y absorber dispositivo conectado a las líneas de aire a presión y vacío para crear presión positiva o negativa dentro de un parche pipeta. </li><li> Baje el parche pipeta en el baño bajo control visual a través del microscopio. En el "osciloscopio" de la ventana, debería ver una corriente que fluye a través de la pipeta. Un cambio de ritmo-como en la amplitud de la corriente debe ser inducida por un pulso de amplitud pequeña tensión (prueba de impulso) aplicado por el macro preestablecido. En este momento, usted debería ser capaz de determinar el valor de la resistencia a la pipeta. La resistencia de nuestras pipetas es típicamente 6.5 mW. </li><li> Corregir el "offset" potencial generada entre la pipeta y el electrodo de referencia. </li><li> Bajo control visual a través del microscopio, llevar la punta de la pipeta cerca de la celda hasta que toque la membrana celular. </li><li> Aplique una presión negativa (20-40 pulgadas de H 2 O) en el interior del parche pipeta. </li><li> Monitorear la formación gigaseal en el "osciloscopio" de la ventana. Usted verá la amplitud de la corriente inducida por el pulso de prueba, disminuye y aumenta el valor de la resistencia a la pipeta&gt; 5 GΩ. Por lo general, las formas gigaseal dentro de una few segundos, pero se puede tomar 1-2 minutos para lograr una gigaseal estable. </li><li> Compensar la capacitancia pipeta ("C-Fast"). </li><li> Ruptura de la membrana de parches mediante la aplicación de presión negativa adicional usando una jeringa de 20 cc. </li><li> Establecer el potencial de retención de 30 mV. Un potencial de retención positiva ayuda a evitar que el calcio dependientes de inactivación del canal CRAC. </li><li> Compensar la capacitancia de la membrana de la célula ("C-lento"), guardar o registrar el valor de C-lento. </li><li> Comprobar el valor de la resistencia de acceso "I s". En nuestros experimentos, la s R es típicamente 7.20 mW. </li><li> Empezar a aplicar una serie de rampas de tensión con una frecuencia de 0.5 Hz (Figura 1) en Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1. En esta solución, la corriente CRAC es insignificante en comparación con la "fuga" de corriente debido a la poca permeabilidad de los canales CRAC para Mg 2 +. Guardar y utilizar las huellas corriente registró en la solución de baño # 1 en los futuros análisis de "filtrar" las corrientes. La amplitud absoluta de la "fuga" de corriente a -100 mV debe ser menor o igual a 5 PA. Si la célula es "permeable", detener la prueba y comenzar de nuevo con una pipeta nueva revisión y una nueva célula. </li><li> Para grabar Ca 2 + a través de los canales actuales CRAC (I Ca-CRAC), sustitución de Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 mM Ca con 20 + 2 que contienen solución del baño # 2 (Tabla 1) al cambiar las válvulas de la perfusión. Esto permite Ca 2 + a fluir a través de los canales CRAC y producir una corriente hacia el interior. En el "osciloscopio" de la ventana, podrás ver el desarrollo del interior rectificar I Ca-CRAC (Figura 2). La amplitud de la corriente con tensiones negativas seguirá aumentando durante 1 min, debido a la Ca 2 +-dependiente de la potenciación de la CRAC actual. </li><li> Aumentar la frecuencia de la estimulación con rampas de tensión a 5 Hz, lo que es necesario registrar el transitorio corriente de Na + a través de los canales CRAC. </li><li> Vuelva a colocar el 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2 con Na + que contienen cationes divalentes sin solución n º 3 (Tabla 1) al cambiar las válvulas de la perfusión. En el "osciloscopio" de la ventana, verás un desarrollo transitorio de mayor amplitud interior rectificar corriente de Na + a través de los canales CRAC (I Na-CRAC, Figura 2). </li><li> Se puede aplicar 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2, que contiene 5.1 M La 3 + en el final del experimento para registrar la "fuga" de corriente. Sin embargo, no encontramos este enfoque es útil porque la "fuga" los cambios actuales en el tiempo y puede llegar a ser más grande o más pequeña al final del experimento. Nosotros preferimos aprovechar la corriente registrado en el Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 en el inicio del experimento como una "fuga" de corriente. </li><li> Guarde las huellas registradas en curso para su posterior análisis. </li></ol> 7. Análisis de Datos <ol><li> Recuperar los registros guardados en el actual software de análisis. Utilizamos el programa de impulso para el análisis. </li><li> Medir las amplitudes de corriente al principio y al final de las rampas de tensión. Nos suelen medir las amplitudes de corriente a -100 mV y 100 mV en el uso de pares de cursores en el "osciloscopio" de la ventana del programa de impulso. </li><li> Exportar los valores de las amplitudes de corriente en un programa gráfico para su posterior análisis y presentación gráfica. Usamos gráfica origen científico y software de análisis, la versión 7. </li></ol> 8. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. CRAC corrientes en una de las células T humanas en reposo. (A), Evolución temporal de las corrientes CRAC registrado en células enteras voltaje-clamp configuración a -100 mV (círculos llenos) y 100 mV (círculos). Antes de la formación gigaseal, el celular se incuba durante unos 10 min en Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 que contiene 0,5 M thapsigargin. Después del rodaje, las soluciones de baño se aplican de forma secuencial de la siguiente manera: Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 (0 + 3 Ca Mg), seguido de 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2 (20 Ca), seguido por la solución de baño de cationes divalentes-free # 3 (DVF), seguido de solución del baño # 2 (20 Ca). La célula fue estimulado con una serie de rampas de tensión como se muestra en la Figura 1. La frecuencia de las rampas de los 5 Hz en la solución del baño # 3 (DVF) y 0,5 Hz en todas las otras soluciones. Tenga en cuenta el lento desarrollo de la I Ca-CRAC después de la aplicación de 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2 y el rápido desarrollo transitoria de I Na-CRAC en la solución de baño de DVF N º 3. (B), Representante de las huellas actuales registrados en las rampas de tensión en Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 ("Escape"), 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2 (20 Ca), y la solución de baño # 3 (DVF). (C, D), relaciones corriente-voltaje de la I Ca-CRAC (C) y Na-CRAC (D) restando "fugas" en curso de las corrientes registradas durante las rampas de tensión en 20 mM Ca 2 + que contienen baño solución # 2 (20 Ca), y la solución de baño # 3 (DVF) que se muestran en el panel (B).

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

La investigación electrofisiológica de las corrientes de CRAC en reposo las células T humanas es una tarea difícil debido a la amplitud endógeno CRAC actual en estas células es pequeño debido al tamaño de células pequeñas (el diámetro de descanso de células T humanas está en el rango de 5.8 micras). Aquí se presenta un procedimiento paso a paso para registrar de forma fiable las corrientes CRAC en el descanso los linfocitos T humanos aislados a partir de células mononucleares de sangre periférica. Esta tecnología nos pe...

<table><tbody><tr><td>Cóctel de Enriquecimiento de Células T Humanas RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Medio de Densidad RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>Medio RPMI 1640 con glutamina/HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>Suero de Ternera Fetal</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>Solución GlutaMAX-I (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Solución de vitaminas RPMI 1640 (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>Solución de aminoácidos 1640 (50X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina Hidrobromuro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de lantano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>Tapsigargina</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Kit de elastómero de silicona Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Recubrimiento protector para semiconductores HIPEC R6101</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa de laboratorio de aislamiento de vibraciones de alto rendimiento serie 63-500</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de parche EPC 10 con cabezal</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido Olympus 1X71 con objetivo de inmersión en aceite de 40x</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Computadora con Windows</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Pulse</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de gráficos y análisis científicos Origin</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas para parche</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio borosilicatado con filamento (diámetro exterior: 1,5 mm y diámetro interior: 1,10 mm)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Microfusor Narashige&amp;rsquo;s</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Anillos tóricos de silicona</td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>Láminas cubreobjetos de 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

de células enteras de grabación de calcio activados por calcio de lanzamiento (crac) las corrientes en los linfocitos t humanos

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

En los linfocitos T, la disminución de Ca2+ en el almacén intracelular de Ca2+ induce la activación de canales de Ca2+ en la membrana plasmática, denominados canales de calcio activados por la liberación de calcio (CRAC, por sus siglas en inglés). Los canales CRAC desempeñan un papel importante en la regulación de la proliferación de linfocitos T y la expresión génica. Se ha relacionado la función anormal de los canales CRAC en los linfocitos T con la inmunodeficiencia combinada grave y enfermedades autoinmunes 1, 2. El estudio de la función de los canales CRAC en linfocitos T humanos podría revelar nuevos mecanismos moleculares que regulan las respuestas inmunitarias normales y desentrañar las causas de enfermedades humanas relacionadas. Las grabaciones electrofisiológicas de las corrientes de membrana proporcionan la evaluación más precisa de las propiedades funcionales de los canales y su regulación. La evaluación electrofisiológica de las corrientes de los canales CRAC en células T Jurkat, una línea celular de leucemia T humana, se realizó por primera vez hace más de 20 años 3; sin embargo, la medición de corrientes CRAC en linfocitos T humanos normales sigue siendo una tarea difícil. Las dificultades para registrar las corrientes de los canales CRAC en linfocitos T normales se ven agravadas por el hecho de que los linfocitos T derivados de sangre son considerablemente más pequeños que las células Jurkat, y por lo tanto, las corrientes CRAC endógenas en células completas son de muy baja amplitud. A continuación, se describe un procedimiento paso a paso que utilizamos habitualmente para registrar corrientes de Ca2+ o Na+ a través de canales CRAC en linfocitos T humanos en reposo, aislados de sangre periférica de voluntarios sanos. El método descrito aquí se adaptó de los procedimientos empleados para registrar corrientes CRAC en células T Jurkat y en linfocitos T humanos activados 4-8.

Ofrecemos un protocolo de paso a paso para la grabación de células enteras patch clamp de calcio activados por calcio de lanzamiento (CRAC) las corrientes en mononucleares de sangre periférica de células derivadas de los linfocitos T humanos.

De células enteras de grabación de calcio activados por calcio de lanzamiento (CRAC) Las corrientes en los linfocitos T humanos

En los linfocitos T, el agotamiento del Ca2+ del depósito de Ca2+ intracelular provoca la activación de los canales de Ca2+ de la plasmalema, denominados canales activados por la liberación de calcio...

Los canales de calcio activados por la liberación de calcio, o canales CRAC, que se localizan en la membrana plasmática, desempeñan un papel importante en la proliferación de linfocitos T y en la estimulación de la expresión génica. La activación de los receptores de linfocitos T mediante un antígeno da lugar a la formación del segundo mensajero trifosfato de adenosina y a la activación de la liberación de calcio desde los depósitos a través de los receptores de trifosfato de adenosina. La disminución en la concentración de calcio dentro del depósito conduce a la activación de los canales CRAC y al consiguiente aumento en la concentración de calcio en el citosol. Las alteraciones en la función de los canales CRAC en los linfocitos T están asociadas con varias enfermedades humanas, incluyendo trastornos de inmunodeficiencia combinada grave y enfermedades autoinmunes.Aquí se presenta un método que permite el registro fiable y reproducible de corrientes endógenas de calcio y sodio a través de canales de fuga en linfocitos T humanos. Primero, se aplica FSA garin, un bloqueador de la ATPasa de calcio del retículo sarcoplásmico-endoplásmico, en una solución extracelular sin calcio que co

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Investigación

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Biology

Biología

La compartimentación de las proteínas, ya sea dentro de la membrana plasmática o en lugares intracelulares es un mecanismo de regulación que pueden influir mucho en los resultados de señalización, por lo que, para comprender la señalización es importante estudiar el comportamiento espacial y temporal de las proteínas implicadas. Se describe aquí un sistema de microscopía TIRF base para estudiar la transducción de señal en las células T, pero es ampliamente aplicable.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

Este video analiza la afluencia de calcio inducida por el receptor de células T en las células T. Los anticuerpos anti-CD3 activan las vías de señalización de las células T, lo que conduce a un aumento de los iones de calcio intracelulares que se unen con el tinte Indo-1. En la citometría de flujo, un cambio de espectro del estado libre de calcio al estado unido al calcio se correlaciona con la afluencia de calcio inducida por el receptor de células T.

Evaluación de la afluencia de calcio inducida por el receptor de células T mediante un tinte indicador de calcio

Se describe el aislamiento de miocitos auriculares humanos que pueden ser utilizados para el Ca...

El aislamiento de miocitos auriculares humanos para la medición simultánea de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitorios y corrientes de membrana

Se describen procedimientos para realizar registros simultáneos del potencial o corriente de membrana y los cambios en la concentración de calcio intracelular. Las neuronas del núcleo supraquiasmático se llenan con el indicador de calcio bis-fura-2 mediante un electrodo de pinza de parche en la configuración de pinza de parche de toda la célula.

Registro electrofisiológico simultáneo e imágenes de calcio de neuronas del núcleo supraquiasmático

El registro de las corrientes de Ca2+ en la membrana frontal de liberación presináptica es clave para una comprensión precisa de la entrada de Ca2+ y la liberación de neurotransmisores. Presentamos una disociación aguda de la médula espinal de la lamprea que produce axones reticuloespinales aislados funcionales, lo que permite el registro directo desde la membrana de la cara de liberación de las terminales presinápticas individuales.

Agudo Disociación de lamprea reticuloespinal axones para permitir la grabación del estreno de la cara de la membrana de individuales Terminales presinápticos funcionales

Aquí presentamos técnicas para obtener imágenes de eventos locales de Ca2+ mediados por IP3 utilizando microscopía de fluorescencia en células de mamíferos intactas cargadas con indicadores de Ca2+ junto con un algoritmo que automatiza la identificación y el análisis de estos eventos.

Imagen Ca Local<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en las células de mamífero en cultivo

Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

Aquí se describen los métodos utilizados para estudiar el efecto funcional de las mutaciones RYR1 expresadas endógenamente en los linfocitos B humanos inmortalizados por el virus de Epstein Barr y las células satélite derivadas de biopsia muscular diferenciadas en miotubos.

Caracterización funcional de variantes de RYR1 humanas expresadas endógenamente

La afluencia de calcio, una medida de la señalización de las células T, es una forma efectiva de analizar las respuestas a la estimulación del receptor de células T. Este protocolo para multiplexar Indo-1 con paneles de anticuerpos dirigidos a moléculas de superficie celular aprovecha las capacidades altamente flexibles de la citometría de flujo de espectro completo.

Análisis de la afluencia de calcio inducida por receptores de células T en células T murinas primarias mediante citometría de flujo de espectro completo

Aquí, proporcionamos un protocolo integral para resolver las señales locales iniciales de Ca2+ , conocidas como microdominios de Ca2+ , en células T primarias murinas y humanas mediante microscopía de fluorescencia. Este protocolo sirve como un recurso valioso para los investigadores que examinan las vías de señalización de Ca2+ dentro de las células inmunitarias y para desentrañar aún más su función.

Obtención de imágenes de microdominios Ca2+ iniciales en células T primarias

Este artículo presenta un método para el monitoreo cuantitativo en tiempo real de las concentraciones de iones de calcio (Ca2+) en células utilizando imágenes de Ca2+ de una sola célula con el colorante Fura-2 / AM. Esta técnica permite una carga eficiente de colorante y un cálculo preciso de los niveles de Ca2+ a través de las relaciones de intensidad de fluorescencia, lo que la convierte en un enfoque simple y rápido para aplicaciones de investigación.

Imágenes de calcio unicelular para estudiar la activación de los canales iónicos de calcio

Aprende a registrar corrientes CRAC en linfocitos T humanos mediante la técnica de patch clamp de célula entera. Este método permite medir de forma fiable la actividad de canales de calcio para estudiar la función inmunitaria.

De células enteras de grabación de calcio activados por calcio de lanzamiento (CRAC) Las corrientes en los linfocitos T humanos

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