Name: De células enteras de grabación de calcio activados por calcio de lanzamiento (CRAC) Las corrientes en los linfocitos T humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Aprende a registrar corrientes CRAC en linfocitos T humanos mediante la técnica de patch clamp de célula entera. Este método permite medir de forma fiable la actividad de canales de calcio para estudiar la función inmunitaria.

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Estamos agradecidos con el Departamento de Fisiología y Biología de Membrana de la Universidad de California Davis para que nos proporciona las instalaciones y un excelente ambiente para los estudios de los canales iónicos.

1. Preparación de los linfocitos T en reposo Humanos <ol><li> Utilizando RosetteSep Humanos Cocktail de enriquecimiento de células T y de densidad media RosetteSep, purificar las células T de muestras de sangre humana de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La población de células resultante debe contener un 95% CD3 + células T en reposo. Purificamos linfocitos T humanos de sangre periférica recogida de voluntarios sanos, de acuerdo con el protocolo aprobado por el Consejo de la Universidad de California Davis Revisión Interna. </li><li> Tras el aislamiento, volver a suspender las células T en reposo, con una densidad de 0,5 x 10 6 células / ml en medio de cultivo celular que contiene medio RPMI-1640 con glutamina y HEPES, complementado con un 10% de suero fetal bovino, 2% Glutamax-I, 1% de RPMI 1640 vitamina solución, una solución de RPMI 1640% aminoácidos, 1% de piruvato de sodio, y el 0,03% β-mercaptoetanol. </li><li> Lugar la suspensión de células en frascos de cultivo celular y mantener a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% de CO 2 durante un máximo de 24 horas antes del experimento. </li></ol> 2. Preparación de la Cámara de grabación <ol><li> Los siguientes son necesarios para preparar las cámaras de grabación: a) el silicio O-rings, b) redondo, 25 mm cubreobjetos limpian con 70% de etanol y H 2 O destilada, c) las mezclas Sylgard184, preparados de acuerdo con las instrucciones del fabricante, yd) dos de 60 x 15 mm Petri. </li><li> Lugar ~ 0,5 ml de la mezcla en un plato Sylgard184 60x15 mm-Petri. </li><li> Sumerja la parte inferior de la junta tórica en la pinza Sylgard184 utilizando. </li><li> Eliminar el exceso de Sylgard184 desde el borde del anillo mediante la colocación de la junta tórica en una superficie limpia, como la otra placa de Petri. </li><li> Coloque el anillo en el cubreobjetos y se presiona. </li><li> Curar la Sylgard184 por las cámaras de calefacción a 85 ° C durante 40-60 minutos o hasta que el Sylgard184 se polimeriza. </li><li> Tienda de las cámaras de grabación en un recipiente de polvo. </li></ol> 3. Preparación de pipetas de parches <ol><li> En el día del experimento, tire pipetas con un diámetro de la punta ~ 2 micras utilizando capilares de vidrio y un extractor de la pipeta. Usamos tubos de borosilicato con filamento (OD: 1.5 mm y ID: 1,10 mm). Pipetas guárdela en un lugar libre de polvo. </li><li> Escudo puntas de pipeta con Sylgard184 o HIPEC revestimiento Semiconductor R6101 de protección, de acuerdo con un procedimiento estándar de 9. </li><li> Suavemente el fuego pulido las pipetas antes del experimento. </li></ol> 4. Preparación de la instalación de patch clamp <ol><li> Configurar y guardar las macros para la formación de gigaseal en el software que controla el amplificador de patch-clamp. Utilizamos un amplificador EPC-10 compatible con Windows XP y el software de pulso para la adquisición de datos. Hemos creado el "set-up", "en las células", y "conjunto de células" macros de acuerdo con el manual de EPC-10 y los utilizan para todos los experimentos. </li><li> Preparar soluciones para baños y soluciones de la pipeta en la Tabla 1 antes del experimento y almacenarlas a 4 º C durante un máximo de 1 semana. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Productos químicos </td><td colspan="3"> Soluciones de Bath (mM) </td><td> Pipeta Solutions (mM) </td></tr><tr><td></td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td><td></td></tr></tbody><tbody><tr><td> CH 3 SO 3 Na </td><td> 130 </td><td> 110 </td><td> 125 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> - </td></tr><tr><td> Ca (OH) 2 </td><td> - </td><td> 20 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> HEDTA </td><td> - </td><td></td><td> 10 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> CS-Aspartate </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 125 </td></tr><tr><td> BAPTA </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Soluciones para el conjunto de células grabaciones actuales CARC. Todos los productos químicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. <ol start="3"><li> Determinar los potenciales de unión líquida (LJ) entre la solución de parche pipeta y cada solución del baño 10. Guardar el valor LJ en el lugar adecuado con el software de adquisición. Por ejemplo, en el programa Pulso insertar el valor en LJ "LJ" control en el "amplificador" de la ventana. </li><li> Configurar y guardar los protocolos de estimulación, como se muestra en la Figura 1, en el lugar apropiado de su software de adquisición antes de los experimentos. En el programa Pulso, se establece el protocolo de adquisición en la "Generación de pulso" de la ventana. <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. . Protocolo de estimulación Rampa de tensión -120 a 100 mV de 50 ms de duración se aplica cada 0,2 a 2 s (5 a 0,5 Hz). Potencial de mantenimiento (V h) entre las rampas se mantiene en 30 mV. </li></ol> 5. Las células de montaje de la platina del microscopio <ol><li> Abrigo de las cámaras de grabación con poli-L-lisina de aproximadamente 20 minutos y lavar con H 2 O y luego con solución salina balanceada de Hank (HBSS) de las placas, las células. </li><li> Placa de 500 l de suspensión celular que contiene 0,2-0,5 x 10 6 células en la cámara y se incuba durante 20 min a 37 ° C. </li><li> Asegure la cámara de registro con las células colocadas en un soporte de cámara. Utilizamos un soporte de cámara a medida, donde la base soporta la parte inferior del cubreobjetos, mientras que la parte superior presiona suavemente contra la parte superior del cubreobjetos. </li><li> Coloque el soporte de la cámara en la platina del microscopio invertido. </li><li> Centrarse en las células de la luz transmitida. Nosotros usamos un objetivo de inmersión 40X. </li><li> Coloque el electrodo de referencia Ag / AgCl en el baño. </li><li> Alinear la multibarrel, impulsado por la gravedad del sistema de perfusión. La punta del tubo de entrada debe ser colocado en un ángulo de 45 ° hasta el fin cubreobjetos para el campo de visión. </li><li> Coloque el tubo de aspiración frente a la punta del tubo de entrada. </li><li> Perfusión de la cámara con tampón fosfato salino (PBS) o HBSS para lavar los medios de cultivo celular y las células unen libremente. </li></ol> 6. CRAC Canal Corrientes grabación <ol><li> Encontrar una célula que se une firmemente a la cubreobjetos. Por lo general selecciona uno de tamaño medio, de células redondas, con una superficie exterior lisa. </li><li> Perfusión de la cámara de grabación con Ca 2 + libre, 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 (Tabla 1) que contiene 0.5-1 thapsigargin M durante 8-10 minutos para bloquear la bomba SERCA. Llevamos a cabo este paso al agotamiento de la tienda antes de la formación gigaseal. </li><li> El uso de un microloader Eppendorf y un P-20 pipeta de desplazamiento, llenar el parche pipeta con la solución de la pipeta (Tabla 1) e insertar el parche pipeta en el soporte de la pipeta en el headstage amplificador. El Ca 2 + quelante BAPTA está incluido en la solución de la pipeta a agotar pasivamente la tienda y para reducir el Ca 2 +-dependiente de inactivación del canal CRAC. </li><li> Aplique una pequeña cantidad de presión positiva (~ 3 cm de H 2 O) en el interior de la pipeta parche antes de entrar en el baño. Usamos una medida de presión y absorber dispositivo conectado a las líneas de aire a presión y vacío para crear presión positiva o negativa dentro de un parche pipeta. </li><li> Baje el parche pipeta en el baño bajo control visual a través del microscopio. En el "osciloscopio" de la ventana, debería ver una corriente que fluye a través de la pipeta. Un cambio de ritmo-como en la amplitud de la corriente debe ser inducida por un pulso de amplitud pequeña tensión (prueba de impulso) aplicado por el macro preestablecido. En este momento, usted debería ser capaz de determinar el valor de la resistencia a la pipeta. La resistencia de nuestras pipetas es típicamente 6.5 mW. </li><li> Corregir el "offset" potencial generada entre la pipeta y el electrodo de referencia. </li><li> Bajo control visual a través del microscopio, llevar la punta de la pipeta cerca de la celda hasta que toque la membrana celular. </li><li> Aplique una presión negativa (20-40 pulgadas de H 2 O) en el interior del parche pipeta. </li><li> Monitorear la formación gigaseal en el "osciloscopio" de la ventana. Usted verá la amplitud de la corriente inducida por el pulso de prueba, disminuye y aumenta el valor de la resistencia a la pipeta&gt; 5 GΩ. Por lo general, las formas gigaseal dentro de una few segundos, pero se puede tomar 1-2 minutos para lograr una gigaseal estable. </li><li> Compensar la capacitancia pipeta ("C-Fast"). </li><li> Ruptura de la membrana de parches mediante la aplicación de presión negativa adicional usando una jeringa de 20 cc. </li><li> Establecer el potencial de retención de 30 mV. Un potencial de retención positiva ayuda a evitar que el calcio dependientes de inactivación del canal CRAC. </li><li> Compensar la capacitancia de la membrana de la célula ("C-lento"), guardar o registrar el valor de C-lento. </li><li> Comprobar el valor de la resistencia de acceso "I s". En nuestros experimentos, la s R es típicamente 7.20 mW. </li><li> Empezar a aplicar una serie de rampas de tensión con una frecuencia de 0.5 Hz (Figura 1) en Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1. En esta solución, la corriente CRAC es insignificante en comparación con la "fuga" de corriente debido a la poca permeabilidad de los canales CRAC para Mg 2 +. Guardar y utilizar las huellas corriente registró en la solución de baño # 1 en los futuros análisis de "filtrar" las corrientes. La amplitud absoluta de la "fuga" de corriente a -100 mV debe ser menor o igual a 5 PA. Si la célula es "permeable", detener la prueba y comenzar de nuevo con una pipeta nueva revisión y una nueva célula. </li><li> Para grabar Ca 2 + a través de los canales actuales CRAC (I Ca-CRAC), sustitución de Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 mM Ca con 20 + 2 que contienen solución del baño # 2 (Tabla 1) al cambiar las válvulas de la perfusión. Esto permite Ca 2 + a fluir a través de los canales CRAC y producir una corriente hacia el interior. En el "osciloscopio" de la ventana, podrás ver el desarrollo del interior rectificar I Ca-CRAC (Figura 2). La amplitud de la corriente con tensiones negativas seguirá aumentando durante 1 min, debido a la Ca 2 +-dependiente de la potenciación de la CRAC actual. </li><li> Aumentar la frecuencia de la estimulación con rampas de tensión a 5 Hz, lo que es necesario registrar el transitorio corriente de Na + a través de los canales CRAC. </li><li> Vuelva a colocar el 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2 con Na + que contienen cationes divalentes sin solución n º 3 (Tabla 1) al cambiar las válvulas de la perfusión. En el "osciloscopio" de la ventana, verás un desarrollo transitorio de mayor amplitud interior rectificar corriente de Na + a través de los canales CRAC (I Na-CRAC, Figura 2). </li><li> Se puede aplicar 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2, que contiene 5.1 M La 3 + en el final del experimento para registrar la "fuga" de corriente. Sin embargo, no encontramos este enfoque es útil porque la "fuga" los cambios actuales en el tiempo y puede llegar a ser más grande o más pequeña al final del experimento. Nosotros preferimos aprovechar la corriente registrado en el Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 en el inicio del experimento como una "fuga" de corriente. </li><li> Guarde las huellas registradas en curso para su posterior análisis. </li></ol> 7. Análisis de Datos <ol><li> Recuperar los registros guardados en el actual software de análisis. Utilizamos el programa de impulso para el análisis. </li><li> Medir las amplitudes de corriente al principio y al final de las rampas de tensión. Nos suelen medir las amplitudes de corriente a -100 mV y 100 mV en el uso de pares de cursores en el "osciloscopio" de la ventana del programa de impulso. </li><li> Exportar los valores de las amplitudes de corriente en un programa gráfico para su posterior análisis y presentación gráfica. Usamos gráfica origen científico y software de análisis, la versión 7. </li></ol> 8. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. CRAC corrientes en una de las células T humanas en reposo. (A), Evolución temporal de las corrientes CRAC registrado en células enteras voltaje-clamp configuración a -100 mV (círculos llenos) y 100 mV (círculos). Antes de la formación gigaseal, el celular se incuba durante unos 10 min en Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 que contiene 0,5 M thapsigargin. Después del rodaje, las soluciones de baño se aplican de forma secuencial de la siguiente manera: Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 (0 + 3 Ca Mg), seguido de 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2 (20 Ca), seguido por la solución de baño de cationes divalentes-free # 3 (DVF), seguido de solución del baño # 2 (20 Ca). La célula fue estimulado con una serie de rampas de tensión como se muestra en la Figura 1. La frecuencia de las rampas de los 5 Hz en la solución del baño # 3 (DVF) y 0,5 Hz en todas las otras soluciones. Tenga en cuenta el lento desarrollo de la I Ca-CRAC después de la aplicación de 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2 y el rápido desarrollo transitoria de I Na-CRAC en la solución de baño de DVF N º 3. (B), Representante de las huellas actuales registrados en las rampas de tensión en Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 ("Escape"), 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2 (20 Ca), y la solución de baño # 3 (DVF). (C, D), relaciones corriente-voltaje de la I Ca-CRAC (C) y Na-CRAC (D) restando "fugas" en curso de las corrientes registradas durante las rampas de tensión en 20 mM Ca 2 + que contienen baño solución # 2 (20 Ca), y la solución de baño # 3 (DVF) que se muestran en el panel (B).

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

La investigación electrofisiológica de las corrientes de CRAC en reposo las células T humanas es una tarea difícil debido a la amplitud endógeno CRAC actual en estas células es pequeño debido al tamaño de células pequeñas (el diámetro de descanso de células T humanas está en el rango de 5.8 micras). Aquí se presenta un procedimiento paso a paso para registrar de forma fiable las corrientes CRAC en el descanso los linfocitos T humanos aislados a partir de células mononucleares de sangre periférica. Esta tecnología nos pe...

<table><tbody><tr><td>Cóctel de Enriquecimiento de Células T Humanas RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Medio de Densidad RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>Medio RPMI 1640 con glutamina/HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>Suero de Ternera Fetal</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>Solución GlutaMAX-I (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Solución de vitaminas RPMI 1640 (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>Solución de aminoácidos 1640 (50X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina Hidrobromuro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de lantano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>Tapsigargina</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Kit de elastómero de silicona Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Recubrimiento protector para semiconductores HIPEC R6101</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa de laboratorio de aislamiento de vibraciones de alto rendimiento serie 63-500</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de parche EPC 10 con cabezal</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido Olympus 1X71 con objetivo de inmersión en aceite de 40x</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Computadora con Windows</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Pulse</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de gráficos y análisis científicos Origin</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas para parche</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio borosilicatado con filamento (diámetro exterior: 1,5 mm y diámetro interior: 1,10 mm)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Microfusor Narashige&amp;rsquo;s</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Anillos tóricos de silicona</td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>Láminas cubreobjetos de 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

de células enteras de grabación de calcio activados por calcio de lanzamiento (crac) las corrientes en los linfocitos t humanos

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

En los linfocitos T, la disminución de Ca2+ en el almacén intracelular de Ca2+ induce la activación de canales de Ca2+ en la membrana plasmática, denominados canales de calcio activados por la liberación de calcio (CRAC, por sus siglas en inglés). Los canales CRAC desempeñan un papel importante en la regulación de la proliferación de linfocitos T y la expresión génica. Se ha relacionado la función anormal de los canales CRAC en los linfocitos T con la inmunodeficiencia combinada grave y enfermedades autoinmunes 1, 2. El estudio de la función de los canales CRAC en linfocitos T humanos podría revelar nuevos mecanismos moleculares que regulan las respuestas inmunitarias normales y desentrañar las causas de enfermedades humanas relacionadas. Las grabaciones electrofisiológicas de las corrientes de membrana proporcionan la evaluación más precisa de las propiedades funcionales de los canales y su regulación. La evaluación electrofisiológica de las corrientes de los canales CRAC en células T Jurkat, una línea celular de leucemia T humana, se realizó por primera vez hace más de 20 años 3; sin embargo, la medición de corrientes CRAC en linfocitos T humanos normales sigue siendo una tarea difícil. Las dificultades para registrar las corrientes de los canales CRAC en linfocitos T normales se ven agravadas por el hecho de que los linfocitos T derivados de sangre son considerablemente más pequeños que las células Jurkat, y por lo tanto, las corrientes CRAC endógenas en células completas son de muy baja amplitud. A continuación, se describe un procedimiento paso a paso que utilizamos habitualmente para registrar corrientes de Ca2+ o Na+ a través de canales CRAC en linfocitos T humanos en reposo, aislados de sangre periférica de voluntarios sanos. El método descrito aquí se adaptó de los procedimientos empleados para registrar corrientes CRAC en células T Jurkat y en linfocitos T humanos activados 4-8.

Ofrecemos un protocolo de paso a paso para la grabación de células enteras patch clamp de calcio activados por calcio de lanzamiento (CRAC) las corrientes en mononucleares de sangre periférica de células derivadas de los linfocitos T humanos.

De células enteras de grabación de calcio activados por calcio de lanzamiento (CRAC) Las corrientes en los linfocitos T humanos

En los linfocitos T, el agotamiento del Ca2+ del depósito de Ca2+ intracelular provoca la activación de los canales de Ca2+ de la plasmalema, denominados canales activados por la liberación de calcio...

Los canales de calcio activados por la liberación de calcio, o canales CRAC, que se localizan en la membrana plasmática, desempeñan un papel importante en la proliferación de linfocitos T y en la estimulación de la expresión génica. La activación de los receptores de linfocitos T mediante un antígeno da lugar a la formación del segundo mensajero trifosfato de adenosina y a la activación de la liberación de calcio desde los depósitos a través de los receptores de trifosfato de adenosina. La disminución en la concentración de calcio dentro del depósito conduce a la activación de los canales CRAC y al consiguiente aumento en la concentración de calcio en el citosol. Las alteraciones en la función de los canales CRAC en los linfocitos T están asociadas con varias enfermedades humanas, incluyendo trastornos de inmunodeficiencia combinada grave y enfermedades autoinmunes.Aquí se presenta un método que permite el registro fiable y reproducible de corrientes endógenas de calcio y sodio a través de canales de fuga en linfocitos T humanos. Primero, se aplica FSA garin, un bloqueador de la ATPasa de calcio del retículo sarcoplásmico-endoplásmico, en una solución extracelular sin calcio que contiene tres milimolares de magnesio para agotar el almacén.Este procedimiento abre los canales de crack pero no induce corriente de crack debido a la baja permeabilidad de los canales de crack al magnesio. Luego se establece un clamp de voltaje en toda la célula sobre una membrana de célula T. La célula se perfunde con una solución de pipeta que contiene una alta concentración del quelante de calcio pta.Posteriormente, se aplican de forma secuencial soluciones extracelulares con calcio o libres de cationes divalentes para activar corrientes medibles de calcio y sodio a través de los canales crack. Los datos resultantes demuestran el nivel de expresión funcional de los canales crack en linfocitos T humanos en reposo. El estudio de las corrientes de membrana a través de los canales crack puede proporcionar información valiosa sobre la regulación y las funciones de estos canales, y establecer su papel en las respuestas inmunitarias normales y en las enfermedades inmunológicas.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al pequeño tamaño de los linfocitos T humanos y a la baja amplitud de las corrientes endógenas de ruptura en estas células. Los linfocitos T humanos positivos para CD3 para este experimento se obtuvieron a partir de una muestra de sangre periférica de un voluntario sano y se aislaron utilizando un cóctel de enriquecimiento de linfocitos T humanos TEP y medio de densidad TEP. De acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito adjunto, las células se mantuvieron en medio de cultivo para linfocitos T a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono.Preparar las siguientes soluciones: solución número uno con tres milimolares de magnesio y sin calcio, solución número dos con 20 milimolares de calcio, solución número tres con 10 milimolares del quelante de calcio H-E-D-T-A y sin iones divalentes, y solución para pipeta que contiene 12 milimolares del quelante de calcio bta. Almacenar las soluciones a cuatro grados Celsius durante hasta una semana. El día del experimento, tirar pipetas con un diámetro de punta de aproximadamente dos micrones utilizando capilares de vidrio y un tirador de pipetas.Utilice tubo de sílice con filamento con la especificación mostrada aquí y enumerada en el texto adjunto. Después de extraer, las puntas de pipeta se recubren con un recubrimiento protector semiconductor PEC R 61 0 1 y se pulen con llama. Almacénelas en un lugar protegido del polvo, como un soporte para pipetas.Abra el software que controla el amplificador de parche aquí. Un amplificador de parche E PC 10 es controlado por el software Pulse. Configure y guarde la configuración en las macros de célula y célula completa utilizadas para la formación del sello giga y el establecimiento de la configuración de célula completa.A continuación, en el software de adquisición, configure y guarde aquí el protocolo de estimulación para registrar las corrientes de ruptura. El protocolo de adquisición en la ventana de generación de impulsos se establece como una rampa de voltaje desde menos 120 hasta más 100 milivoltios durante 50 milisegundos de duración.Cree dos protocolos de estimulación con frecuencias de estimulación de voltaje en rampa de 0,5 hercios y cinco hercios, y guárdelos en la ventana de generación de pulsos con los nombres rampa uno y rampa dos, respectivamente. Para preparar las células, plaque 500 microlitros de la suspensión celular que contiene entre 0,2 y 0,5 millones de células en una cámara de registro compuesta por un cubreobjetos recubierto con polilisina y un anillo de silicona en forma de O adherido. Incube durante 20 minutos a 37 grados Celsius.Tras la incubación, fije la cámara de registro en un soporte para cámaras. Aquí se utiliza un soporte personalizado en el que la parte inferior sostiene el cubreobjetos en la base de la cámara y la parte superior presiona contra la parte superior del cubreobjetos. Coloque el soporte para cámaras sobre la platina del microscopio invertido utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 40 x y una iluminación de campo claro.Busque un campo de células y enfoque. Coloque el electrodo de referencia de cloruro de plata en el baño. Luego alinee un sistema de perfusión gravitacional multibarril colocando la punta del tubo de entrada a 45 grados respecto al cubreobjetos, cerca del campo de visión; el tubo de succión se inserta en la parte superior del soporte de la cámara.Gire la parte superior del soporte de la cámara hasta que el tubo de succión esté opuesto al tubo de entrada para realizar el canal correcto. Las grabaciones de corriente comienzan abriendo la válvula del sistema de perfusión para perfundir la cámara de registro con solución libre de calcio. La solución de baño número uno, que contiene 3 milimolares de magnesio, suplementada con 0,5 a 1 micromolar de AP argón durante 8 a 10 minutos, bloquea la bomba circa.Este paso agota el almacén de calcio. A continuación, utilice un microcargador einor con una pipeta de desplazamiento de aire P 20. Para llenar la pipeta con la solución, inserte la pipeta en el soporte sobre la etapa del amplificador aquí.Un dispositivo personalizado de succión y presión se conecta al aire presurizado y a las líneas de vacío. Para generar presión positiva o negativa en una pipeta de registro, aplique una pequeña presión positiva de aproximadamente tres pulgadas de agua dentro de la pipeta conectando la pipeta a la salida del dispositivo de succión y presión mediante el tubo de conexión. Haga clic en la tecla de control de configuración en la ventana del parche clamp EPC 10 en la pantalla del ordenador.Para ejecutar la macro de configuración, busque una célula redonda de tamaño promedio con una superficie externa lisa que esté firmemente adherida al cubreobjetos. Luego, baje el electrodo de registro en el baño bajo control visual mediante el microscopio en la ventana del osciloscopio.La corriente que fluye a través de la pipeta puede observarse tras sumergir la pipeta en la solución de baño. Un cambio semejante a un escalón en la amplitud de la corriente es provocado por el pulso de voltaje de prueba de cinco milivoltios aplicado a la pipeta mediante el macro de configuración. El software del pulso calcula automáticamente la resistencia de la pipeta y la muestra en la ventana de resistencia de la membrana.En la pantalla del ordenador, la resistencia de la pipeta suele ser de cinco a seis megaohmios. Haga clic en la tecla de control automático en la ventana del amplificador en la pantalla del ordenador para corregir el potencial de desplazamiento generado entre la pipeta y el electrodo de referencia. La corriente de línea base se desplazará a un nivel de corriente cero.Utilice el micromanipulador para acercar la punta de la pipeta hasta tocar la membrana celular. Una vez establecido el contacto, se producirá una disminución en la amplitud de la corriente provocada por el pulso de prueba. Aplique presión negativa de 20 a 40 pulgadas de agua a la pipeta de registro.Observe la formación del sello gigaseal en la ventana del osciloscopio. La amplitud de la corriente evocada por el pulso de prueba debe disminuir gradualmente a medida que el valor de la resistencia de la pipeta aumenta hasta más de cinco gigaohmios. Por lo general, el contacto del sello gigaseal se forma rápidamente, aunque también puede tomar de uno a dos minutos lograr un sello gigaseal estable.Una vez logrado el sello giga, desconecte el porta-pipetas del dispositivo de succión por presión retirando el tubo de conexión de la salida. Haga clic en la tecla de control de ruptura en la pantalla del ordenador para ejecutar la macro de ruptura, que fue configurada previamente antes del experimento. Según el manual del EPC 10, compense la capacitancia de la pipeta haciendo clic en la tecla de control automático en la ventana de cfat.En la ventana del osciloscopio, el transitorio de corriente desaparecerá y el valor de la capacitancia de la pipeta aparecerá en la ventana cfat para romper la membrana celular. Dentro de la pipeta, conecte esta a una jeringa de 20 centímetros cúbicos mediante el tubo conectivo y retire el émbolo para aplicar presión negativa adicional a la pipeta. Cuando la membrana celular dentro de la pipeta se rompa, aparecerán dos transitorios de corriente que cargarán la membrana celular a un nuevo nivel de voltaje. Haga clic en la tecla de control de célula entera en la pantalla del ordenador para ejecutar la macro preestablecida de célula entera.Luego, para establecer el potencial de retención, escriba +30 milivoltios en la ventana de V membrana; un potencial de retención positivo ayuda a prevenir la activación del canal de fuga dependiente del calcio. A continuación, haga clic en la tecla de control automático en la ventana C lenta. Para compensar la capacitancia celular en la ventana del osciloscopio, el transitorio de corriente desaparecerá.Los valores de la capacitancia celular y la resistencia en serie aparecerán respectivamente en las ventanas C lenta y R serie. La resistencia en serie suele estar dentro del rango de siete a 20 mega. Los valores de C lenta, que corresponden a los valores de capacitancia celular, suelen estar en el rango de 1,5 a 2,5 pico faradios.En células T humanas en reposo, haga clic en la tecla de control de rampa uno en la ventana del osciloscopio para aplicar una serie de rampas de voltaje con una frecuencia de 0.5 hertz. Esto ejecutará el protocolo de estimulación generado y guardado previamente en la ventana del osciloscopio. Se muestran las corrientes evocadas por las rampas de voltaje. Registre.Estos rastros de corriente en la solución número uno sin calcio que contiene tres milimolares de magnesio. En esta solución, la corriente de crack es muy pequeña debido a la baja permeabilidad de los canales de crack para el magnesio Saban. Utilice estos rastros en análisis futuros como corrientes de fuga.La amplitud absoluta de la fuga a menos 100 milivoltios debe ser igual o menor que cinco picoamperios. Si la célula tiene fugas, detenga el experimento y comience de nuevo con una nueva pipeta de registro y una nueva célula.A continuación, para registrar la corriente de calcio mediante canales TRP, cambie las válvulas de perfusión para sustituir la solución de baño número uno por la solución de baño número dos que contiene 20 milimolares de calcio. Esto permite que los iones de calcio fluyan a través de los canales TRP y produzcan una corriente entrante en la ventana del osciloscopio. Se desarrolla una corriente de calcio entrante a través de los canales TRP con amplitud de corriente a voltajes negativos, que continúa aumentando durante aproximadamente un minuto debido a la potenciación dependiente del calcio de la corriente TRP.Haga clic en la tecla de control de rampa dos en la ventana del osciloscopio para ejecutar un protocolo de estimulación preestablecido, que cambia la frecuencia de estimulación mediante rampas de voltaje con un aumento de cinco hercios en la frecuencia de estimulación, lo que ayuda a registrar la corriente máxima de sodio a través de los canales CRAC, que es de naturaleza transitoria. A continuación, cambie nuevamente las válvulas de perfusión para sustituir la solución de baño número dos por la solución número tres, que contiene sodio y carece de cationes divalentes, en la ventana del osciloscopio. Se desarrolla una corriente transitoria de sodio entrante de mayor amplitud y rectificación interna a través de los canales CRAC.Una vez finalizado el experimento, cierre el archivo; esto guarda las trazas de corriente registradas para su posterior análisis. Para analizar los datos, recupere los registros de corriente guardados en el software de análisis. Aquí se utiliza el software Pulse para realizar el análisis, empleando pares de cursores en la ventana del osciloscopio del programa Pulse. Mida las amplitudes de corriente al principio y al final de las rampas de voltaje.Las amplitudes de corriente se miden a menos 100 milivoltios y a más 100 milivoltios. Exporte los valores de las amplitudes de corriente a un programa gráfico como el software Origin para graficación y análisis científico. Para análisis adicionales y presentación gráfica, se midieron las corrientes de ruptura en células T en reposo CD3 positivas de un sujeto humano sano utilizando el método descrito aquí; esta figura muestra un curso temporal de las corrientes de ruptura registradas en configuración de bloqueo de voltaje en toda la célula a menos 100 milivoltios, indicado por los círculos rellenos, y a más 100 milivoltios, indicado por los círculos abiertos.Antes de la formación del sello gigaseal, la célula se preincubó durante aproximadamente 10 minutos en solución de baño número uno sin calcio y con 3 milimolares de magnesio que contenía 0,5 micromolares de ortogon. Las soluciones se aplicaron secuencialmente de la siguiente manera: solución de baño número uno sin calcio y con 3 milimolares de magnesio, seguida de la solución de baño número dos con 20 milimolares de calcio, seguida de la solución de baño número tres libre de cationes divalentes, seguida nuevamente por la solución de baño número dos con 20 milimolares de calcio. La célula se estimuló con una serie de rampas de voltaje desde −120 milivoltios hasta +100 milivoltios, como se muestra aquí.Se aplicaron rampas de voltaje cada 200 milisegundos o a una frecuencia de cinco hercios en la solución de rana número tres libre de cationes divalentes, y cada dos segundos o a una frecuencia de 0,5 hercios en todas las demás soluciones. Observe el lento desarrollo de la corriente de calcio a través de los canales de ruptura tras la aplicación de la solución de rana número dos que contiene 20 milimolares de calcio, y el rápido desarrollo transitorio de la corriente de sodio a través de los canales de ruptura en la solución de rana número tres libre de cationes divalentes. Esta figura muestra trazos de corriente representativos registrados durante rampas de voltaje en ausencia de calcio.Solución de baño número uno con 3 mM de magnesio, solución de baño número dos con 20 mM de calcio y solución de baño libre de cationes divalentes número tres. Las trazas de corriente de calcio y sodio durante las rampas de voltaje individuales se pueden obtener restando las corrientes registradas en la solución de baño número uno con 3 mM de magnesio y sin calcio de las corrientes registradas en la solución de baño número dos con 20 mM de calcio y en la solución de baño libre de cationes divalentes número tres. Las trazas de corriente resultantes, que muestran relaciones corriente-voltaje típicas de las corrientes de calcio y sodio a través de canales CRAC, se observan aquí.Una vez dominada esta técnica y realizados correctamente todos los pasos del procedimiento, se pueden registrar corrientes de canales de fuga desde cinco hasta diez células al día. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo registrar corrientes de corrección en reposo en linfocitos T humanos. Siguiendo este procedimiento, también debería ser capaz de registrar corrientes correctas en otras células del sistema inmunitario, como linfocitos T humanos activados, monocitos, macrófagos y líneas celulares. Electrofisiológico.La grabación de las corrientes del canal CRAC en las células del sistema inmunitario podría permitir a los investigadores establecer su papel en la homeostasis del calcio en las células inmunitarias.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

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