Aislamiento de células del cerebro y la médula espinal mononucleares uso de gradientes de Percoll

Las células inmunitarias infiltran el sistema nervioso central durante infecciones, traumatismos, autoinmunidad o neurodegeneración. Aunque los enfoques histoquímicos pueden utilizarse para determinar la ubicación de las células infiltrantes y analizar la patología asociada, estas técnicas están limitadas por el número de anticuerpos que pueden usarse simultáneamente. Aquí se muestra un método para el aislamiento rápido de células mononucleares a partir de tejidos cerebrales y de la médula espinal, en el cual el tejido diseccionado se homogeniza primero.

A continuación, se establece un gradiente de perol y, tras la centrifugación, se recogen las células mononucleares de la interfase. Finalmente, las células se lavan y tiñen con anticuerpos. Mediante el análisis de citometría de flujo, se distinguen las células hematogénicas y la microglía de vigilancia, y se pueden determinar sus proporciones relativas durante estados patológicos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el gradiente de Aris o la histoquímica, es que requiere menos tiempo.

Esto le permite procesar más tejidos al mismo tiempo. Palino A, un técnico de mi laboratorio, demostrará la configuración del gradiente. Prepare los reactivos que se necesitarán para este protocolo. Comience con cuatro mililitros de percol isotónico stock, denominado SIP, por cerebro.

Para hacer esto, combine nueve partes de perol con una parte de HBSS 10 veces sin calcio y magnesio, mezclando por inversión. A continuación, prepare 70 % per call mezclando el SIP preparado con HBSS 1 vez sin calcio y magnesio. Luego, distribuya dos mililitros del 70 % per cole en un tubo cónico de polipropileno de 15 mililitros para recolectar el tejido.

Para este procedimiento, coloque los cerebros y médulas espinales disecados de todos los ratones del estudio en vasos de precipitados que contengan 10 mililitros de RPMI sobre hielo. A continuación, transfiera el tejido a un homogenizador de 7 u 15 mililitros que contenga tres mililitros de HBSS al uno por ciento con un pistilo de ajuste suelto. Suavemente, haga una suspensión celular con el pistilo, luego cambie a un pistilo tipo B de ajuste ajustado y disocie aún más los tejidos.

Una vez que el tejido esté homogeneizado, agregue RPMI o HBSS al 1x hasta un volumen final de siete mililitros y proceda a preparar el gradiente para establecer el gradiente de PERCOCO. Comience agregando tres mililitros de SIP a la suspensión celular hasta una concentración final de PERCOCO del 30 %. Tenga en cuenta que el perol debe usarse a temperatura ambiente. Si se utiliza frío, las células tienden a agruparse y la separación celular es menos eficiente.

A continuación, utilizando nuestra pipeta auxiliar en modo de gravedad, coloque lentamente la suspensión celular de 10 mililitros encima del SIP al 70%. Evite mezclar las soluciones al 70% y al 30%. Este es el paso más crítico del procedimiento.

Debería ser visible una línea plana muy nítida en la unión del 70 al 30%. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las soluciones al tercer y 70% se mezclarán durante la estratificación. Siguiente paso, comprometiendo la interfase, centrifugar durante 30 minutos a 500 Gs a 18 grados Celsius.

Asegúrese de que la centrífuga se detenga con una desaceleración mínima o nula para que la interfase no se perturbe. Después de la centrifugación de los gradientes, una capa gruesa y viscosa de residuos debe acumularse en la parte superior del tubo. La siguiente capa es la capa amarillenta de 30% por núcleo, que en ocasiones contiene residuos.

A continuación se encuentra la interfase 70 a 30, que debe presentar un halo blanco definido y contiene las células mononucleares. Finalmente, en la parte inferior del tubo está la capa clara de Percol 70 %. Si no se observa ninguna interfase, el rendimiento de células probablemente será muy bajo, lo que dificultará enormemente cualquier análisis posterior.

Por lo tanto, en ese momento, podría ser necesario preparar suspensiones frescas de células para reducir la contaminación. Retire cuidadosamente la capa de residuos de la parte superior del tubo y deséchela. Luego, utilizando una pipeta de plástico, pase a través del 30% superior de la capa de núcleo y recoja de dos a tres mililitros de la interfase 70-30, y transfiera esta fracción a un tubo cónico limpio que contenga ocho mililitros de HBSS al uno por ciento.

Mezcle las interfaces diluidas varias veces mediante inversión, luego centrifugue durante siete minutos a 500 GS a 18 grados Celsius. Tras la centrifugación, retire el sobrenadante y resuspenda el precipitado. En un mililitro de tampón de tinción celular, transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros y lávela una vez más.

Utilice una microcentrífuga a 10,000 GS durante un minuto a cuatro grados Celsius antes de proceder con la tinción con anticuerpos; resuspenda los pellets en 50 microlitros de anti-US CD 16, CD 32 purificado, diluido uno a 200 en tampón de tinción celular para bloquear los sitios de unión FC. Como en cualquier procedimiento de tinción, es imprescindible que todos los anticuerpos se titulen adecuadamente; incube en hielo durante 10 minutos. Durante la incubación, retire de dos a cinco microlitros de células y cuéntelos utilizando un hemocitómetro.

Los tejidos combinados de cerebro y médula espinal naive deben producir alrededor de tres a cinco veces 10 a la cinco células por ratón. Los cerebros inflamados tendrán cantidades variables de células inflamatorias dependiendo del punto temporal en el que se recojan y del modelo de enfermedad. Tras la incubación con CD 16 y CD 32, añada 50 microlitros de una mezcla de cóctel de anticuerpos específica para células inmunitarias. La mezcla utilizada en este ejemplo contiene anticuerpos contra CD 45, CD cuatro y CD 19; incube en hielo durante 30 minutos.

Es importante que cada anticuerpo se titule primero. Para evaluar la dilución óptima, utilice combinaciones adecuadas de fluorocromos seleccionadas según las capacidades de los láseres y los ajustes de filtros de su citómetro de flujo particular. Después de teñir las células, lávelas en tampón de tinción celular añadiendo un mililitro de tampón de tinción celular y centrifugándolas durante un minuto.

Al alcanzar 10.000 G tras la centrifugación, deseche el sobrenadante, luego resuspenda los pellet en 100 a 200 microlitros de tampón de tinción celular para análisis citométrico de flujo inmediato o para análisis posterior. Resuspenda las células en formaldehído al 2 % preparado en PBS y almacénelas durante la noche a cuatro grados Celsius. Aquí se muestran células mononucleares obtenidas e incubadas con bloqueador de FC, seguidas de anticuerpos anti-CD45, CD4 y CD19.

De acuerdo con el protocolo demostrado mediante citometría de flujo, la tinción de CD45 separa claramente las células hematogénicas de alta expresión de CD45 de las microglías de vigilancia CD45 débil (DIM). Esta figura compara las células aisladas de un cerebro naïve y de un cerebro inflamado de un ratón inducido para desarrollar encefalomielitis autoinmune experimental. La intensidad de CD45 APC se muestra en el eje Y, donde se visualizan tres poblaciones distintas en el cerebro naïve.

Se detectan muy pocos números de células CD45 altas. Habitualmente menos del 2% de la población aislada total. En comparación, los cerebros de ratones afectados por EAE muestran una afluencia masiva de células sanguíneas reclutadas al cerebro.

La adición de otros marcadores de superficie celular, como CD11b, CD4, CD8, etc., permite una caracterización más detallada de la población CD45 alta. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres a cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que los enfoques histológicos en conjunto con la fenotipificación inmune mediante citometría de flujo son fundamentales para caracterizar completamente la composición de los infiltrados inflamatorios del SNC.