Name: Aislamiento de células del cerebro y la médula espinal mononucleares uso de gradientes de Percoll (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprende a aislar células mononucleares del sistema nervioso central en ratones mediante gradientes de Percoll discontinuos. Este protocolo rápido permite el análisis fenotípico detallado por citometría de flujo.

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Este trabajo fue apoyado por la National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T para AEC) y la Universidad de Texas en San Antonio.

Preparación de los reactivos Preparar acciones isotónica Percoll (SIP), 4 ml por el cerebro, mediante la mezcla de 9 partes de Percoll con una parte de HBSS 10 veces sin Ca + + y Mg + +. Prepare SIP en un 70% en 1X HBSS sin Ca + + y Mg + +, 2 ml por cada cerebro se distribuye en un tubo de polipropileno cónico de 15 ml. Nota: Se recomienda que Percoll se debe utilizar a temperatura ambiente, si se utiliza en frío, las células tienden a agruparse y separación celular es menos eficaz. Tejido de recogida y homogeneización Anestesiar a los ratones y perfundir a través del ventrículo izquierdo con helado de HBSS 1X. Diseccionar el cerebro y la médula espinal y mantener en RPMI sin rojo fenol hasta que todos los ratones son sacrificados. Tejidos a cabo en 7 o 15 ml Dounce homogeneizadora que contiene 3 ml de RPMI, con cuidado hacer una suspensión de células con una mano suelta (un tamaño), seguido de un mortero de Tigh-instalación (tamaño B) a disociar aún más los tejidos. Completa el volumen de las suspensiones celulares a 7 ml con RPMI. Gradiente de establecer Añadir 3 ml de la SIP a la suspensión celular para hacer un último sorbo del 30% Poco a poco la capa de la suspensión de células de 10 ml en la parte superior de la SIP el 70%. Este es el paso más crítico del procedimiento, utilice una pipeta de ayuda establecidos en el modo de evitar la mezcla de gravedad el 70% y 30% de las soluciones. Una línea plana muy claro debe ser visible en el cruce de 70% -30%. Centrifugar 30 minutos a 500G 18 ° C. Asegúrese de centrífuga se detiene con un mínimo o ningún freno para que la interfase no se altera. Usando una pipeta, retire suavemente la capa de escombros de la parte superior del tubo y recoger 2,0-3,0 ml de la interfase 70% -30% en un tubo limpio cónico que contiene 8 ml de 1X HBSS. Asegúrese de que el Percoll que contiene la interfase se diluye alrededor de tres veces, mezcla un par de veces por inversión y centrifugre min 7 de 500G a 18 ° C. Resuspender el pellet en 1 ml de tampón de tinción celular y transferirlo a un tubo de 1.5 ml y lavar una vez más utilizando una centrifugadora micro-a 10.000 G 1 min a 4 ° C. Tinción de anticuerpos Pellets Resuspender en 50 l de agua purificada anti-ratón CD16/CD32 diluido 1:200 en buffer de tinción celular para bloquear los sitios de unión Fc. Incubar en hielo durante 10 min. Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Añadir 50 l de mezcla de anticuerpos cócteles e incubar en hielo durante 30 minutos. Cada anticuerpo debe ser el primero titulado para evaluar la dilución óptima. Uso adecuado de las combinaciones de fluorocromos elegidos en función de las capacidades del láser y la configuración de los filtros de su citómetro de flujo particular. Lavar las células en un tampón de tinción de células, pellets de volver a suspender en 100-200 l de buffer de tinción celular y de analizar de inmediato en el citómetro, o, alternativamente, las células pueden ser resuspendidas en el 2% de paraformaldehído (PFA), preparado en PBS y se almacenan durante la noche a 4 ° C . Los resultados representativos: Después de girar los gradientes, el 70% -30% de la interfase debe tener definido un halo blanco, y la cuantificación de las células se recuperó de un ratón ingenuo debe producir 5.3 x 10 5 células por ratón (cerebro, además de la médula espinal). Cerebro inflamado podría tener que van del número de células inflamatorias en función de la lesión del SNC o modelo de la enfermedad (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/2348/2348fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Aislamiento de células mononucleares, de ingenuo y EAE-cerebro en la enfermedad de pico. Las células del cerebro suspensiones fueron separadas en discontinuo 70% / 30% de los gradientes de Percoll. Manchadas las células fueron incubadas con el FC bloque seguido por anticuerpos anti-CD45 durante 30 minutos sobre el hielo. Las células fueron lavadas en buffer de tinción de células, y se fija en el 2% antes de la adquisición de PFA en un LSR-II. CD45 intensidad se mide en el eje Y, en tres poblaciones distintas se visualizan. Además de la caracterización del fenotipo inmunológico de las células CD45 de alta infiltración se implementa el uso de anticuerpos adicionales y, posteriormente, analizadas por citometría de flujo.

<ol><li>Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Juedes, A. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+infiltrating+central+nervous+system+APCs+regulate+the+emergence+and+resolution+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).</li>
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<li>Mildner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).</li>
<li>Djukic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+monocytes+engraft+in+the+brain%2C+differentiate+into+microglia+and+contribute+to+the+pathology+following+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice.</a> Brain. 129, 2394-2403 (2006).</li>
</ol>

Los análisis de marcadores de superficie celular en los leucocitos del SNC de los tejidos normales de ratón y se inflama se ha utilizado por décadas varios 1.3. Protocolos de aislamiento se basan en la separación de la microglía y leucocitos por cuatro densidad de centrifugación. Aquí se describe un método rápido y eficaz de aislar a los leucocitos del SNC con gradientes de Percoll discontinua. Después del aislamiento de las células, tinción con anticuerpos diferentes, tales como, pero no se limita...

Homogeneización de tejidos y degradados <ul><li> Percoll (Amersham) </li><li> Solución salina equilibrada de Hanks 10X, sin calcio y magnesio (Gibco) </li><li> Medio RPMI 1640 sin rojo fenol (Gibco) </li><li> 7 ml o 15 ml de tejido Dounce Molinos (VWR) </li></ul> Citometría de flujo <ul><li> Celular tinción de amortiguación (Biolegend) </li><li> Rata purificado anti-ratón CD16/CD32 (ratón BD Fc Block), BD Pharmingen </li><li> Hemocitómetro (Fisher) </li><li> Anti-CD45 de ratón (clon 30-F11), CD4 (clon RM4-5), CD19 (clon 6D5), BioLegend </li><li> Fosfato de 10X de solución salina tamponada, sin calcio y magnesio (Thermo Scientific) </li><li> Paraformaldehído (Sigma Aldrich) </li><li> Análisis de citometría de flujo realizado con un LSR II (BD Biosciences) </li></ul>

aislamiento de células del cerebro y la médula espinal mononucleares uso de gradientes de percoll

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

El aislamiento de las células inmunes que se infiltran en el sistema nervioso central (SNC) durante la infección, traumatismo, enfermedades autoinmunes o la neurodegeneración, es a menudo necesaria para definir su fenotipo y funciones efectoras. Métodos histoquímicos son fundamentales para determinar la ubicación de la infiltración de las células y para analizar el sistema nervioso central patología asociada. Sin embargo, in-situ histoquímica y técnicas de inmunofluorescencia tinción se ven limitados por el número de anticuerpos que se pueden utilizar en un momento único para caracterizar los subtipos de células inmunes en un determinado tejido. Por lo tanto, los enfoques histológicos en relación con el fenotipo inmunológico por citometría de flujo son fundamentales para caracterizar la composición de la infiltración del SNC local. Este protocolo se basa en la separación de suspensiones celulares del SNC más discontinuo gradientes de Percoll. El presente artículo describe un protocolo rápido para aislar eficazmente células mononucleares de tejidos de la médula espinal y el cerebro que puede ser efectivamente utilizada para la identificación de las diferentes poblaciones de células inmunes en una sola muestra por citometría de flujo.

El presente artículo describe un protocolo rápido para aislar eficazmente células mononucleares de tejidos de la médula espinal y el cerebro que puede ser efectivamente utilizado para el análisis de citometría de flujo.

Aislamiento de células del cerebro y la médula espinal mononucleares uso de gradientes de Percoll

El aislamiento de las células inmunitarias que infiltran el sistema nervioso central (SNC) durante una infección, traumatismo, autoinmunidad o neurodegeneración es a menudo necesario...

Las células inmunitarias infiltran el sistema nervioso central durante infecciones, traumatismos, autoinmunidad o neurodegeneración. Aunque los enfoques histoquímicos pueden utilizarse para determinar la ubicación de las células infiltrantes y analizar la patología asociada, estas técnicas están limitadas por el número de anticuerpos que pueden usarse simultáneamente. Aquí se muestra un método para el aislamiento rápido de células mononucleares a partir de tejidos cerebrales y de la médula espinal, en el cual el tejido diseccionado se homogeniza primero.A continuación, se establece un gradiente de perol y, tras la centrifugación, se recogen las células mononucleares de la interfase. Finalmente, las células se lavan y tiñen con anticuerpos. Mediante el análisis de citometría de flujo, se distinguen las células hematogénicas y la microglía de vigilancia, y se pueden determinar sus proporciones relativas durante estados patológicos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el gradiente de Aris o la histoquímica, es que requiere menos tiempo.Esto le permite procesar más tejidos al mismo tiempo. Palino A, un técnico de mi laboratorio, demostrará la configuración del gradiente. Prepare los reactivos que se necesitarán para este protocolo. Comience con cuatro mililitros de percol isotónico stock, denominado SIP, por cerebro.Para hacer esto, combine nueve partes de perol con una parte de HBSS 10 veces sin calcio y magnesio, mezclando por inversión. A continuación, prepare 70 % per call mezclando el SIP preparado con HBSS 1 vez sin calcio y magnesio. Luego, distribuya dos mililitros del 70 % per cole en un tubo cónico de polipropileno de 15 mililitros para recolectar el tejido.Para este procedimiento, coloque los cerebros y médulas espinales disecados de todos los ratones del estudio en vasos de precipitados que contengan 10 mililitros de RPMI sobre hielo. A continuación, transfiera el tejido a un homogenizador de 7 u 15 mililitros que contenga tres mililitros de HBSS al uno por ciento con un pistilo de ajuste suelto. Suavemente, haga una suspensión celular con el pistilo, luego cambie a un pistilo tipo B de ajuste ajustado y disocie aún más los tejidos.Una vez que el tejido esté homogeneizado, agregue RPMI o HBSS al 1x hasta un volumen final de siete mililitros y proceda a preparar el gradiente para establecer el gradiente de PERCOCO. Comience agregando tres mililitros de SIP a la suspensión celular hasta una concentración final de PERCOCO del 30 %. Tenga en cuenta que el perol debe usarse a temperatura ambiente. Si se utiliza frío, las células tienden a agruparse y la separación celular es menos eficiente.A continuación, utilizando nuestra pipeta auxiliar en modo de gravedad, coloque lentamente la suspensión celular de 10 mililitros encima del SIP al 70%. Evite mezclar las soluciones al 70% y al 30%. Este es el paso más crítico del procedimiento.Debería ser visible una línea plana muy nítida en la unión del 70 al 30%. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las soluciones al tercer y 70% se mezclarán durante la estratificación. Siguiente paso, comprometiendo la interfase, centrifugar durante 30 minutos a 500 Gs a 18 grados Celsius.Asegúrese de que la centrífuga se detenga con una desaceleración mínima o nula para que la interfase no se perturbe. Después de la centrifugación de los gradientes, una capa gruesa y viscosa de residuos debe acumularse en la parte superior del tubo. La siguiente capa es la capa amarillenta de 30% por núcleo, que en ocasiones contiene residuos.A continuación se encuentra la interfase 70 a 30, que debe presentar un halo blanco definido y contiene las células mononucleares. Finalmente, en la parte inferior del tubo está la capa clara de Percol 70 %. Si no se observa ninguna interfase, el rendimiento de células probablemente será muy bajo, lo que dificultará enormemente cualquier análisis posterior.Por lo tanto, en ese momento, podría ser necesario preparar suspensiones frescas de células para reducir la contaminación. Retire cuidadosamente la capa de residuos de la parte superior del tubo y deséchela. Luego, utilizando una pipeta de plástico, pase a través del 30% superior de la capa de núcleo y recoja de dos a tres mililitros de la interfase 70-30, y transfiera esta fracción a un tubo cónico limpio que contenga ocho mililitros de HBSS al uno por ciento.Mezcle las interfaces diluidas varias veces mediante inversión, luego centrifugue durante siete minutos a 500 GS a 18 grados Celsius. Tras la centrifugación, retire el sobrenadante y resuspenda el precipitado. En un mililitro de tampón de tinción celular, transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros y lávela una vez más.Utilice una microcentrífuga a 10,000 GS durante un minuto a cuatro grados Celsius antes de proceder con la tinción con anticuerpos; resuspenda los pellets en 50 microlitros de anti-US CD 16, CD 32 purificado, diluido uno a 200 en tampón de tinción celular para bloquear los sitios de unión FC. Como en cualquier procedimiento de tinción, es imprescindible que todos los anticuerpos se titulen adecuadamente; incube en hielo durante 10 minutos. Durante la incubación, retire de dos a cinco microlitros de células y cuéntelos utilizando un hemocitómetro.Los tejidos combinados de cerebro y médula espinal naive deben producir alrededor de tres a cinco veces 10 a la cinco células por ratón. Los cerebros inflamados tendrán cantidades variables de células inflamatorias dependiendo del punto temporal en el que se recojan y del modelo de enfermedad. Tras la incubación con CD 16 y CD 32, añada 50 microlitros de una mezcla de cóctel de anticuerpos específica para células inmunitarias. La mezcla utilizada en este ejemplo contiene anticuerpos contra CD 45, CD cuatro y CD 19; incube en hielo durante 30 minutos.Es importante que cada anticuerpo se titule primero. Para evaluar la dilución óptima, utilice combinaciones adecuadas de fluorocromos seleccionadas según las capacidades de los láseres y los ajustes de filtros de su citómetro de flujo particular. Después de teñir las células, lávelas en tampón de tinción celular añadiendo un mililitro de tampón de tinción celular y centrifugándolas durante un minuto.Al alcanzar 10.000 G tras la centrifugación, deseche el sobrenadante, luego resuspenda los pellet en 100 a 200 microlitros de tampón de tinción celular para análisis citométrico de flujo inmediato o para análisis posterior. Resuspenda las células en formaldehído al 2 % preparado en PBS y almacénelas durante la noche a cuatro grados Celsius. Aquí se muestran células mononucleares obtenidas e incubadas con bloqueador de FC, seguidas de anticuerpos anti-CD45, CD4 y CD19.De acuerdo con el protocolo demostrado mediante citometría de flujo, la tinción de CD45 separa claramente las células hematogénicas de alta expresión de CD45 de las microglías de vigilancia CD45 débil (DIM). Esta figura compara las células aisladas de un cerebro naïve y de un cerebro inflamado de un ratón inducido para desarrollar encefalomielitis autoinmune experimental. La intensidad de CD45 APC se muestra en el eje Y, donde se visualizan tres poblaciones distintas en el cerebro naïve.Se detectan muy pocos números de células CD45 altas. Habitualmente menos del 2% de la población aislada total. En comparación, los cerebros de ratones afectados por EAE muestran una afluencia masiva de células sanguíneas reclutadas al cerebro.La adición de otros marcadores de superficie celular, como CD11b, CD4, CD8, etc., permite una caracterización más detallada de la población CD45 alta. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres a cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que los enfoques histológicos en conjunto con la fenotipificación inmune mediante citometría de flujo son fundamentales para caracterizar completamente la composición de los infiltrados inflamatorios del SNC.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video se demuestra la forma de aislar las células mononucleares del sistema nervioso central de ratones con encefalomielitis autoinmune experimental.

Aislamiento de células mononucleares de la del sistema nervioso central de ratas con EAE

Aquí presentamos un método para aislar y cultivar cerebelosa gránulo células progenitoras de neuronas y las neuronas del cerebelo gránulo de ratón postnatal.

Aislamiento y cultivo de Post-Natal células de ratón cerebelosa gránulo Progenitor neuronas y las neuronas

Un método rápido para obtener la infiltración de leucocitos en el cerebro murino se describe. Este método utiliza un gradiente de Percoll continua y discontinua gradiente de Ficoll para seleccionar y purificar la capa de leucocitos enriquecido. Leucocitos aislados se puede caracterizar por las mediciones de citometría de flujo.

El aislamiento de la infiltración de leucocitos cerebro-

En este video, realizamos el aislamiento de células mononucleares del cerebro de un ratón utilizando centrifugación por gradiente de densidad. La suspensión de célula mononuclear aislada se puede utilizar para análisis posteriores posteriores.

Aislamiento de células mononucleares a partir de cerebro de ratón: una técnica de centrifugación de gradiente de densidad para aislar células mononucleares residentes en el cerebro

En este video describimos un protocolo paso a paso para aislar neuronas de la médula espinal de un ratón neonatal para estudios in vitro.

Aislamiento de neuronas de la médula espinal: un procedimiento de gradiente de densidad para aislar neuronas de la médula espinal neonatal para estudios in vitro

El video muestra el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica infiltrantes de tumores del cerebro de un ratón utilizando disociación mecánica y digestión enzimática. A esto le sigue la centrifugación en gradiente de densidad para recoger las células inmunitarias para su posterior análisis.

Aislamiento de células inmunitarias infiltrantes de tumores de un cerebro murino

El video muestra la preparación de una suspensión unicelular de células inmunitarias a partir de un tejido cerebral murino. Implica la digestión enzimática para liberar células del tejido cerebral, seguida de la centrifugación en gradiente de densidad para aislar las células inmunitarias en función de sus densidades para obtener la suspensión unicelular.

Preparación de una suspensión unicelular de células inmunitarias a partir de tejido cerebral murino

Este video muestra una técnica para aislar y cultivar células gliales mixtas primarias de tejido de la médula espinal de ratón adulto. El protocolo implica la digestión enzimática del tejido, seguida de la eliminación de las membranas celulares rotas y los restos de mielina para obtener una población de una sola célula. A continuación, las células se cultivan en medios optimizados para el crecimiento de células gliales mixtas.

Establecimiento de cultivos primarios de células gliales mixtas a partir de la médula espinal de un ratón

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Este artículo presenta dos protocolos optimizados para examinar las células inmunitarias residentes y derivadas periféricas dentro del sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, la médula espinal y las meninges. Cada uno de estos protocolos ayuda a determinar la función y composición de las células que ocupan estos compartimentos en estado estacionario y en condiciones inflamatorias.

Aislamiento de tejidos del sistema nervioso central y meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias

Hasta la fecha, los protocolos para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central del mismo ratón son una demanda insatisfecha. El protocolo muestra un procedimiento aplicable en ratones con encefalomielitis autoinmune naïve y experimental para investigar redes celulares complejas durante la neuroinflamación y, al mismo tiempo, reducir el número de ratones requerido.

Aislamiento simultáneo de los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central de ratones adultos con encefalomielitis autoinmune

Aprende a aislar células mononucleares del sistema nervioso central en ratones mediante gradientes de Percoll discontinuos. Este protocolo rápido permite el análisis fenotípico detallado por citometría de flujo.

Aislamiento de células del cerebro y la médula espinal mononucleares uso de gradientes de Percoll

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