Aislamiento de células del cerebro y la médula espinal mononucleares uso de gradientes de Percoll

Las células inmunitarias se infiltran en el sistema nervioso central durante una infección, un traumatismo, la autoinmunidad o la neurodegeneración. Si bien los enfoques histoquímicos se pueden utilizar para determinar la ubicación de las células infiltrantes y analizar la patología asociada, estas técnicas están limitadas por el número de anticuerpos que se pueden usar simultáneamente. Aquí se muestra un método para el aislamiento rápido de células mononucleares de tejidos cerebrales y de la médula espinal en el que primero se homogeneiza el tejido disecado.

A continuación, se establece un gradiente de perol y, tras la centrifugación, se recogen las células mononucleares de la interfaz. Finalmente, las células se enjuagan y se tiñen con anticuerpos A través del análisis de citometría de flujo, se distinguen las células hematógenas y la microglía de vigilancia y se pueden determinar sus proporciones relativas durante los estados de enfermedad. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el gradiente de Aris o en este tipo de histoquímica, es que requiere menos tiempo.

Esto le permite procesar más tejidos al mismo tiempo. La demostración de la configuración del gradiente será palino Un técnico de mi laboratorio Prepare los reactivos que se necesitarán para este protocolo. A partir de cuatro mililitros de perol isotónico de caldo, conocido como SIP, por cerebro.

Para hacer esto, combine nueve partes de perol con una parte de 10 veces HBSS sin calcio y magnesio mezclados por inversión. A continuación, prepare el 70% por llamada mientras mezcla el SIP preparado con una vez HBSS sin calcio y magnesio. A continuación, dispense dos mililitros del 70% por cole en un tubo cónico de polipropileno de 15 mililitros para recoger el tejido.

Para este procedimiento, coloque los cerebros y la médula espinal disecados de todos los ratones del estudio en vasos de precipitados que contengan 10 mililitros de RPMI sobre hielo. A continuación, transfiera el tejido a un homogeneizador de plumón de siete o 15 mililitros que contenga tres mililitros de un par de HBSS con un tamaño holgado. Un mortero crea suavemente una suspensión celular, luego cambia a un mortero ajustado de tamaño B y disocia aún más los tejidos.

Una vez homogeneizado el tejido, se añade RPMI o una vez HBSS hasta un volumen final de siete mililitros y se procede a configurar el gradiente para configurar el gradiente de percoco. Comience agregando tres mililitros de SIP a la suspensión celular hasta una concentración final de PERCOCO del 30%Tenga en cuenta que el perol debe usarse a temperatura ambiente. Si se usa en frío, las células tienden a agruparse y la separación celular es menos eficiente.

A continuación, utilizando nuestro modo de ajuste de gravedad de ayuda a la pipeta, superponga lentamente la suspensión de celdas de 10 mililitros sobre el 70% SIP. Evite mezclar las soluciones de 70% y 30%. Este es el paso más crítico del procedimiento.

Una línea plana muy clara debe ser visible en el cruce del 70 al 30%. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la tercera y la 70% de las soluciones se mezclarán durante la estratificación. Siguiente paso, comprometer la interfaz Centrífuga 30 minutos de 500 Gs a 18 grados Celsius.

Asegúrese de que la centrífuga se detenga con una interrupción mínima o sin interrupción para que la interfaz no se altere. Después de girar los gradientes, se debe acumular una capa gruesa y viscosa de desechos en la parte superior del tubo. La siguiente capa es la amarillenta del 30% por núcleo, que a veces contiene desechos.

La siguiente es la interfaz 70 a 30, que debe tener un halo blanco definido y contiene las células mononucleares. Finalmente, en la parte inferior del tubo se encuentra la capa transparente 70% de perol. Si no se observa ninguna interfaz, es probable que el rendimiento de las células sea muy bajo, lo que dificultará enormemente un análisis posterior.

Por lo tanto, en ese momento, es posible que se requieran suspensiones de células frescas para disminuir la contaminación. Retire con cuidado la capa de residuos de la parte superior del tubo y deséchela. Luego, usando una pipeta de plástico, pase por la capa superior del 30% por núcleo y recoja de dos a tres mililitros de la interfase 70 30 y transfiérala a un tubo cónico limpio que contenga ocho mililitros de una vez HBSS.

Mezcle las interfaces diluidas varias veces por inversión, luego centrifugue durante siete minutos a 500 GS a 18 grados Celsius. Después del centrifugado, retire la supena y vuelva a suspender el pellet. En un mililitro de tampón de tinción celular, transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros y lávelo una vez más.

Usando una microcentrífuga a 10, 000 GS durante un minuto a cuatro grados Celsius antes de proceder con la tinción de anticuerpos para realizar la tinción de anticuerpos, vuelva a suspender los gránulos en 50 microlitros de CD 16, CD 32 anti-US purificado, diluido de uno a 200 en tampón de tinción celular para bloquear los sitios de unión de FC. Al igual que para cualquier procedimiento de tinción, es imperativo que todos los anticuerpos se titulen adecuadamente e incuben en hielo durante 10 minutos. Durante la incubación, extraiga de dos a cinco microlitros de células y cuéntelas con un hemocímetro.

La combinación de tejidos ingenuos del cerebro y la médula espinal debería producir alrededor de tres a cinco veces 10 a cinco células por ratón. Los cerebros inflamados tendrán un número variable de células inflamatorias dependiendo del momento en el que se recojan y del modelo de enfermedad Después de la incubación con CD 16 y CD 32, agregue 50 microlitros de mezcla de cóctel de anticuerpos específicos para células inmunitarias. La mezcla utilizada en este ejemplo contiene anticuerpos contra CD 45, CD 4 y CD 19 incubados en hielo durante 30 minutos.

Es importante destacar que primero se debe valorar cada anticuerpo. Para evaluar la dilución óptima, utilice combinaciones apropiadas de fluorocromo elegidas de acuerdo con las capacidades de la configuración del láser y el filtro de su flujo particular. El citómetro, después de teñir las células, lávelas en tampón de tinción celular agregando un mililitro de tampón de tinción celular y girándolas durante un minuto.

A los 10.000 Gs después del centrifugado, deseche el agente supino, luego vuelva a suspender las paletas en 100 a 200 microlitros de tampón de tinción celular para un análisis citométrico de flujo inmediato para su posterior análisis. Reus suspende las celdas en formaldehído al 2%par preparado en PBS y almacena durante la noche a cuatro grados centígrados. Aquí se muestran células mononucleares obtenidas e incubadas con el bloque FC, seguidas de anticuerpos anti CD 45, CD 4 y CD 19.

De acuerdo con el protocolo demostrado por citometría de flujo, la tinción de CD 45 separa bien las células hematógenas altas de CD 45 de la microglía de vigilancia de CD 45, DIM. Esta figura compara las células aisladas de un cerebro ingenuo y un cerebro inflamado de un ratón inducido a desarrollar encefalomielitis autoinmune experimental. CD 45 La intensidad de una PC se muestra en el eje Y, donde se visualizan tres poblaciones distintas en el cerebro ingenuo.

Se detecta muy poco número de células CD 45 altas. Por lo general, menos del 2% del total de la población aislada. En comparación, los cerebros de ratones afectados por EAE muestran una afluencia masiva de células sanguíneas reclutadas en el cerebro.

La adición de otros marcadores de superficie celular como CD 11 b, CD cuatro, CD ocho, etcétera, permite una mayor caracterización de la alta población de CD 45 Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas si se realiza correctamente. Al asistir a este procedimiento, es importante recordar que los abordajes histológicos junto con el fenotipado inmune por citometría de flujo son críticos para caracterizar completamente la composición de los infiltrados inflamatorios del SNC.