Monitoreo células inmunes Tráfico Varillas fluorescente priones horas de la infección intraperitoneal

El objetivo principal de este procedimiento es monitorear la captación y el tráfico de priones por parte de células inmunitarias en las horas posteriores a la infección. Para comenzar, purifique y marque con un fluorocromo los bastones de priones agregados provenientes del cerebro infectado, luego inocule estos bastones de priones en la cavidad peritoneal de ratones. Después de dos horas, recupere las células del peritoneo, el bazo y también de los ganglios linfáticos mediastínicos y mesentéricos. Finalmente, tiña las células recuperadas con marcadores fenotípicos inmunitarios y analícelas para detectar la retención de PreOn.

Por ejemplo, los resultados de la citometría de flujo pueden utilizarse para demostrar que los bacilos priónicos son retenidos y transportados principalmente por macrófagos y células dendríticas, secundariamente por monocitos y terciariamente por linfocitos B. Este sistema experimental está diseñado para arrojar luz sobre los reservorios de priónicos y los posibles objetivos terapéuticos al responder preguntas clave, como qué células captan los PreOn inmediatamente después de la infección, adónde los transportan y con qué rapidez llegan allí.

Para demostrar este procedimiento, estarán Crystal, Mt. And Brady Michael, estudiantes de posgrado de mi laboratorio. Con el fin de recolectar las proteínas PreOn, homogenice 100 miligramos de tejido cerebral infectado con PreOn en 900 mililitros de tampón de homogenización frío durante un minuto a velocidad máxima en una licuadora comercial y coloque inmediatamente en hielo durante dos minutos. Repita este proceso tres veces para aumentar el rendimiento de proteína.

Centrifugar el homogenato durante 10 minutos a 3000 Gs y cuatro grados Celsius. Retirar y guardar el sobrenadante en hielo. Suspender nuevamente el precipitado en un litro de hp y repetir los pasos de homogenización y centrifugación.

Ahora, reúna el sobrenadante y centrifugue durante 60 minutos a 100.000 ×g y 0 °C. Descarte el sobrenadante. Re_suspenda el precipitado en 100 mililitros de TBST.

Estime la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford y ajuste el volumen a cinco miligramos por mililitro de proteína en TBST. Enfríe en hielo durante 30 minutos. Nuevamente, centrifugue durante 30 minutos a 100.000 ×g y 0 grados Celsius.

Deseche el SNA y lave el precipitado primero con 50 mililitros de TBST. Luego, suspenda el precipitado resultante en 100 mililitros de TBS 1X que contenga 1% de sarcosil y una mezcla de inhibidores de proteasas, y agite durante 120 minutos a 37 grados Celsius. Para realizar un gradiente de sacarosa, coloque la muestra sobre 900 mililitros de sacarosa 320 milimolar y centrifugue durante 60 minutos.

A 100.000 GS y 10 grados Celsius. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 10 mililitros de cloruro de sodio 2,3 molar, con 5% de Sarco seal. A continuación, someta la muestra a sonicación cinco veces durante 40 segundos a un 70% de la potencia máxima, con intervalos de un minuto.

Eluir un mililitro de muestra en tubos Eppendorf y centrifugar durante 15 minutos a 13.000 ×g y 4 °C. Lavar los sedimentos dos veces con TBS y almacenar los stocks a -70 °C. Conjugue un tubo de varillas PreOn purificadas utilizando un vial del fluorocromo DITE 649 según el protocolo del fabricante.

Finalmente, intercambie el tampón de marcado con Dite por PBS mediante centrifugación a través de columnas de filtro. Almacene en alícuotas de 20 microlitros a menos 70 grados Celsius, protegido de la luz, hasta su uso. Esta sección comprende la inoculación intraperitoneal, el prion, y la recuperación de células del peritoneo, los ganglios linfáticos mediastínicos y mesentéricos y el bazo inmediatamente antes del uso del prion fluorescente en bucle D.

Sujete al ratón por el pelaje del cuello con el pulgar y el índice, tomando entre uno y 50 ratones en PBS. Gire suavemente al ratón para que quede frente a usted y sujete la cola con el meñique. Coloque al ratón en posición de supinación, elevando la parte trasera por encima de la cabeza y sosteniéndolo ligeramente cabeza abajo.

Utilizando una jeringa de insulina de calibre 30, inyecte 100 microlitros de bastones fluorescentes de pion, un centímetro lateral a la línea media y uno a dos centímetros anterior a la articulación iliaca escro. Introduzca la aguja un centímetro a través de la piel dirigida 45 grados medialmente para los ratones de control; utilice una dilución de uno a 50 de microesferas fluorescentes o PBS solo. Según el diseño experimental, incube los ratones durante el tiempo asignado para comenzar los análisis.

Sacrifique los ratones de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité de cuidado y uso de animales. Inyecte 10 mililitros de PBS en la cavidad peritoneal utilizando una jeringa de 12 mililitros y una aguja de 25 gauge. Mueva suavemente al ratón longitudinalmente durante un minuto para continuar con la disección del ratón.

Moje completamente el lado ventral del pelaje del ratón con etanol al 70 %. Con pinzas, levante la piel en la línea media justo debajo de la caja torácica y haga una pequeña incisión en la piel con tijeras. Realice una incisión de tres a cinco centímetros de longitud en la piel en ambas direcciones, hacia la cabeza y la cola, respectivamente.

Realice incisiones de dos centímetros desde la línea media hacia lateralmente desde cada extremo, retire y sujete la piel para exponer las cavidades peritoneal y torácica. Recupere la suspensión celular del peritoneo utilizando la misma jeringa y una aguja de calibre 16. Coloque el exudado en un tubo cónico de 15 mililitros y guárdelo sobre hielo.

Corte cuidadosamente la delgada membrana translúcida que rodea el peritoneo y refleje el tórax para revelar el mediastino. Localice ahora y retire dos o cuatro ganglios linfáticos mediastínicos, ligeramente dorsales y adyacentes lateralmente al timo, medialmente adyacentes a la arteria braquiocefálica cerca del lado ventral de la tráquea. A continuación, localice y retire hasta seis ganglios linfáticos mesentéricos embebidos en el tejido mesentérico blando y blanco que ancla los intestinos a la pared abdominal posterior.

Reserve los ganglios linfáticos en un mililitro de medio RPMI 1640, manteniéndolos en hielo hasta que la disección esté completa. Finalmente, localice y extraiga el bazo. Un órgano alargado de color rojo oscuro ubicado justo lateral a la línea media y dorsal a los intestinos, en el lado izquierdo del ratón.

Utilizando el émbolo de una jeringa de un mililitro, macere y presione los ganglios linfáticos a través de un colador de malla de 40 micrones en tres mililitros de PBS en una placa de Petri de plástico. Enjuague el colador con otros dos mililitros adicionales de PBS y transfiera la suspensión celular total de cinco mililitros a un tubo cónico de 15 mililitros. Asimismo, enjuague la placa de Petri con otros cinco mililitros adicionales de PBS y transfiera al mismo tubo.

Centrifugar la muestra durante cinco minutos a 250 ×g. Desechar el sobrenadante y resuspender el botón celular. En un mililitro de tampón fax, transferir las células aisladas a un tubo EOR de 1,5 mililitros.

Típicamente, este protocolo de tinción puede utilizarse para identificar subpoblaciones de células inmunitarias, usando anticuerpos fluorescentes contra marcadores de superficie celular inmunitaria bien caracterizados para lu todos los anticuerpos en tampón fax. Inmediatamente antes de su uso. Cuente las células y alícuota 10 a la sexta células en tubos einor, forme un pellet de células por centrifugación y lave el pellet dos veces con un mililitro de tampón fax para bloquear los receptores FC endógenos.

Incube las células en 100 microlitros de dos nanogramos por mililitro de ratón anti-US CD 1632 durante 20 minutos en el pellet de hielo y lave las células con tampón fax. A continuación, agregue 100 microlitros de un nanogramo por mililitro del anticuerpo o anticuerpos fluorescentes apropiados a cada muestra e incube en hielo. Durante una hora, agregue 100 microlitros de tampón fax solo a las células de control, pelete y lave las células dos veces con tampón fax.

Re suspender las células en un mililitro de tampón act, incubar en hielo durante un minuto. Para lisar el sedimento de glóbulos rojos y lavar las células, usar tampón fax; resuspender las células en un mililitro de tampón fax. Analizar las muestras en un citómetro de flujo, típicamente con láseres de excitación de 405, 488 y 633 nanómetros, y cinco a 10 detectores de emisión fluorescente.

El prion crudo, el homogenado de cerebro infectado, está altamente enriquecido en priones. El proceso de purificación implica detergente, solubilización y ultracentrifugación del homogenado de cerebro de alce E2. El producto es una proteasa.

El análisis de fax resistente a la K de poblaciones celulares específicas demuestra que las células presentadoras de antígenos migran al peritoneo en dos horas y retienen las microesferas fluorescentes y los bastones priónicos. Las células de los ratones inoculados con microesferas y prión mostraron fluorescencia significativa, especialmente en monocitos, células dendríticas y macrófagos.

Se encontraron también monocitos, células dendríticas y macrófagos portadores de PreOn en los ganglios linfáticos mediastínicos. Dos horas después de la inoculación, no detectamos perlas ni bastones de PreOn en los ganglios linfáticos mesentéricos. En este experimento, el video demostró varios protocolos para purificar bastones de priones agregados a partir de cerebro infectado, realizar inyecciones intraperitoneales, identificar y aislar correctamente los ganglios linfáticos, y finalmente aislar y teñir células inmunitarias.