Emparejados grabaciones patch clamp de neurona motora y el músculo esquelético de destino en el pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es obtener grabaciones electrofisiológicas simultáneas del potencial de acción de una neurona motora y la respuesta sináptica asociada en el músculo objetivo. Esto se logra primero removiendo la piel del lado dorsal del pez. El segundo paso del procedimiento consiste en exponer la médula espinal eliminando todas las células musculares dorsales superpuestas.

El tercer paso del procedimiento consiste en exponer el músculo rápido objetivo eliminando la capa superior del músculo lento. El paso final del procedimiento es realizar un clampaje de corriente en la neurona primaria coddle o en la neurona cap y un clampaje de voltaje en el músculo esquelético objetivo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran las respuestas sinápticas en el músculo asociadas al disparo de potenciales de acción de la neurona motora mediante el clampaje de corriente simultáneo de la neurona motora y el clampaje de voltaje del músculo objetivo.

La preparación de pez superiores de LaVar ofrece una combinación de ventajas: facilita el registro emparejado de la neurona motora y el músculo esquelético, el pequeño tamaño del músculo permite un buen control de voltaje, y las características estereotipadas de la neurona motora capilar permiten una identificación y acceso fáciles. Ahora, describiré paso a paso los procedimientos necesarios para establecer el registro de parche en la neurona y el músculo. Antes de comenzar el procedimiento, prepare cinco soluciones clave, que incluyen: solución de baño, solución de baño con Trica, solución de baño con IDE, solución interna para neuronas y solución interna para músculo.

A continuación, recolecte un pez cebra larvario individual entre las edades de 72 a 96 horas y colóquelo en solución de baño con trica. Dentro de un minuto de la exposición al anestésico, el pez no responderá al tacto. Coloque el pez sobre un recipiente de plástico y, utilizando un microscopio estereoscópico, seccionar la cabeza con una hoja de afeitar de doble filo.

Transfiera el pez a una cámara de grabación de vidrio recubierta con sard y llena con solución bass. Cree un colgajo de piel cerca del extremo rostral del pez con una aguja que proporcionará un agarre adecuado para un par de pinzas finas. Retire la piel sobrepuesta agarrándola cerca de la aguja rostral con un par de pinzas finas.

Pelar lentamente en la dirección coddle para retirar la piel. Tratar el pez con tres mililitros de solución de baño con forma IDE durante tres a cinco minutos para bloquear las contracciones musculares que podrían interferir con las grabaciones. Lavar cinco veces con solución de baño normal.

Retire una parte de la capa superficial del músculo en cinco a seis segmentos raspando suavemente con el lado de un alfiler de tungsteno. Transfiera el pez a un microscopio vertical ubicado dentro de una jaula de Faraday para protegerlo del ruido eléctrico. El microscopio está equipado con una platina fija, un objetivo de larga distancia de trabajo, 40 x y un zoom de 0,5 a 4 x.

El microscopio está montado sobre una platina de traslación motorizada XY. Para mover la preparación entre el nervio y el músculo con alto aumento, el uso de óptica de contraste por interferencia diferencial ayuda a visualizar las neuronas con un aumento de 0,5x. Utilice una pipeta de orificio ancho de 15 micrones para eliminar el músculo sobreyacente y exponer la médula espinal.

Se aplica presión negativa mediante una jeringa desechable de tres cc y se extraen las células musculares una por una. Este procedimiento se repite en cinco o seis segmentos dorsales del músculo esquelético. La misma pipeta de gran apertura se utiliza también para eliminar las dos capas superiores del músculo ventral y obtener el músculo esquelético rápido objetivo.

Esto completa la preparación para las grabaciones emparejadas y se aumenta el zoom del microscopio a aproximadamente 1,6 x. Se examinan los segmentos limpios para localizar las neuronas del casquete. Cada segmento HEMI de la médula espinal contiene una gran neurona motora del casquete de 10 micrones de diámetro.

Este soma con forma de lágrima está ubicado superficialmente bajo la médula espinal Jira, cerca del extremo más distal del límite segmentario. Se selecciona una neurona cap para la grabación y se escanea el campo muscular ventral del segmento coddle asociado para verificar su integridad. Se colocan dos electrodos de parche para la grabación, uno para la neurona y un segundo para el músculo.

El electrodo superior tiene una punta cónica poco pronunciada para penetrar la duramadre espinal resistente y una abertura en la punta de aproximadamente dos micrones. El electrodo inferior tiene una punta cónica más pronunciada para la grabación con clamp de voltaje de baja resistencia del músculo esquelético. Coloque el electrodo neuronal en un ángulo de aproximadamente 30 grados para penetrar la duramadre espinal.

Aproximadamente medio segmento hacia la parte rostral del neurona con caperuza seleccionado, avance el electrodo utilizando un manipulador axial mientras aplica una presión positiva suave y continua de aproximadamente 60 milímetros de mercurio. Cuando el electrodo atraviesa la duramadre, la neurona con caperuza puede desplazarse debido a la perfusión proveniente del electrodo, lo que requiere un reajuste del enfoque. Cuando el electrodo toca el SOMA de la neurona con caperuza, se libera la presión positiva y generalmente se produce de inmediato la formación de un sello gigaseal.

Sin embargo, en algunos casos en los que no se logra formar un sello, es necesario aplicar una presión negativa suave. Tras la formación del sello, el potencial del electrodo se ajusta a menos 80 milivoltios y la aplicación de presión negativa rompe la membrana celular. La neurona en capucha se caracteriza por una resistencia de entrada de 140 a 180 megaohmios y un potencial de acción que supera los más 40 milivoltios.

Esto se prueba inyectando pasos despolarizantes incrementalmente crecientes bajo sujeción de corriente hasta que se genera el potencial de acción. A continuación, se reubica el microscopio hacia el músculo ventral utilizando el traductor motorizado XY. Con alto aumento, se selecciona una célula muscular rápida del campo objetivo.

El electrodo muscular se avanza hacia la célula muscular objetivo bajo presión positiva, la cual al liberarse forma un sello gigaseal; el potencial del electrodo se ajusta a menos 50 milivoltios para inactivar los canales de sodio. Y mediante succión suave, se rompe la membrana celular. Una caída en la resistencia a 100-200 megaohmios y la aparición repentina de grandes transitorios capacitivos indican la entrada exitosa para probar el par.

Se registra la neurona motora mientras se despolariza mediante inyecciones de corriente cada vez mayores hasta que se desencadena un potencial de acción. En este punto, debería desencadenarse una corriente de placa motora en el músculo; la estimulación continua de la neurona motora a un hercio da como resultado corrientes de placa motora sin fallos. Cuando la frecuencia del estímulo aumenta a 100 hercios, las corrientes de placa motora fluctúan en amplitud y experimentan un agotamiento funcional dentro de los 10 segundos de estimulación.

Típicamente, la grabación de la neurona es estable durante hasta una hora, pero las células musculares se deterioran, lo que se refleja en un aumento de la resistencia en serie. Cuando esto ocurre, el experimento se termina o se realiza un sellado con micropipeta en otra célula muscular. Todas las grabaciones deben completarse dentro de una hora.

Una vez dominado un par, la grabación puede completarse en una a una hora y media. También es posible obtener uno o dos pares adicionales en los segmentos adyacentes. Un día típico de grabación producirá de dos a tres pares.

Los registros emparejados de neuronas motoras y músculo esquelético ofrecen una oportunidad única para explorar el funcionamiento fundamental de la transmisión neuromuscular. Cuando se utilizan junto con líneas de peces mutantes de motilidad, pueden localizar la causa de la disfunción neuromuscular y proporcionar nuevas perspectivas sobre los mecanismos subyacentes a enfermedades humanas como el síndrome metastásico.