Name: Transfección y mutagénesis de los genes diana en células de mosquito por nucleico cerrado modificado ácido oligonucleótidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprende mutagénesis dirigida en células de mosquito Anopheles usando oligonucleótidos de ácido nucleico cerrado. Este método permite la edición precisa de genes para estudios de biología de vectores y control de enfermedades.

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Nos gustaría dar las gracias a Abbie Spinner en el Centro Nacional de Investigación de Primates de California por su ayuda con la citometría de flujo. Este estudio fue apoyado por fondos del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID), Institutos Nacionales de Salud (NIH) AI073745, AI080799 y AI078183.

<ol><li> Antes de iniciar el protocolo, es importante para determinar que las células de mosquito utilizados en el experimento son saludables y en la confluencia ~ 80% si el tratamiento (Figura 1). Células cubierto o insalubres se traducirá en la eficiencia de transfección de baja y le dará los resultados inconsistentes. </li><li> Calentar todos los medios de comunicación antes de su uso en un baño de agua de 28 ° C durante 30 minutos. <ol class="lalpha"><li> A. stephensi MSQ43 células requieren E5 medio: MEM, w Earle / glutamina, 5% de FCS inactivado por calor, el 0,2% de D-glucosa, 1% de penicilina-estreptomicina, y el 1% no aminoácidos esenciales. </li><li> A. gambiae células SUA5B requieren S2 medio: Drosophila de Schneider medio, el 5% de FCS inactivado por calor, y el 1% de penicilina-estreptomicina antibiótico </li></ol></li><li> Descongelar y almacenar todos los materiales de reactivo de transfección, plásmidos y oligonucleótidos en el hielo. </li><li> Todos los procedimientos deben llevarse a cabo en una campana de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril. </li><li> Para células adherentes (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) aspirado de los viejos medios sin molestar a las células, añadir un volumen equivalente de medio fresco que se ha calentado a 28 ° C, y luego enjuague las células de la parte inferior de la frasco con una pipeta. </li><li> La concentración de células debe ser determinada y ajustada a una concentración final de 1x10 6 células / ml. Las células se pueden mantener a temperatura ambiente, mientras que la preparación de materiales de transfección reactivo. </li><li> Añadir 1 ml de células de mosquito (1x10 6 células / ml) a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Establecer un plato para cada condición experimental (ver más abajo). La tabla I es un sistema de pipeteo para una transfección general. La Tabla II resume cinco condiciones para la prueba de mutagénesis con éxito de un solo nucleótido con BFP específicos LNA-ons. Los dos primeros, y pGFP pBFP, son los controles positivos y negativos, respectivamente. El resto son condiciones experimentales de pBFPs con concentraciones crecientes de BFP específicos LNA-ons. En los pasos 8 a 12, añadir un volumen adecuado de reactivo en consecuencia para cada condición. </li><li> La transferencia de ADN plásmido a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y agregar el volumen apropiado de tampón de la CE. <ol class="lalpha"><li> Para un ADN plásmido l (1 mg / l), añadir 99 l de tampón CE. </li><li> Por un pGFP l (1 g / l), añadir 99 l de tampón CE. </li><li> Por un pBFP l (1 g / l), añadir 99 l de tampón CE. </li><li> Por un pBFP l (1 g / l) y una l ON (mg / l), añadir 98 l de tampón CE. </li><li> Por un pBFP l (1 g / l) y 5 l ON (1 g / l), añadir 94 l de tampón CE. </li><li> Por un pBFP l (1 g / l) y 10 l ON (1 g / l), añadir 89 l de tampón CE. </li></ol></li><li> Luego agregue lentamente reforzador por 1 mg de ADN utilizado. <ol class="lalpha"><li> Por un plásmido de ADN l, añadir 8 l Enhancer. </li><li> Por un pGFP l, añadir 8 l Enhancer. </li><li> Por un pBFP l, añadir 8 l Enhancer. </li><li> Por un pBFP l y l 1 ON, añadir 16 l Enhancer. </li><li> Por un pBFP l y l 5 ON, añadir 48 l Enhancer. </li><li> Por un pBFP l l 10 y ON, añadir 88 l Enhancer. </li></ol></li><li> Vortex ADN / buffer / Enhancer mezcla durante 1 segundo y asegúrese de que toda la solución está en la parte inferior del tubo. A continuación, se incuba a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Añadir el reactivo Effectene por ADN plásmido 1 mg y agite por 10 segundos. Compruebe que toda la solución está en el fondo del tubo y luego se incuban a temperatura ambiente durante 10 min. <ol class="lalpha"><li> Por un plásmido de ADN l, añadir 10 Effectene l (Tabla I). </li><li> Por un pGFP l, añadir 10 Effectene l (Tabla II). </li><li> Por un pBFP l, añadir 10 Effectene l (Tabla II). </li><li> Por un pBFP l y l 1 ON, añadir 20 Effectene l (Tabla II). </li><li> Por un pBFP l y l 5 ON, añadir 60 Effectene l (Tabla II). </li><li> Por un pBFP l l 10 y ON, añadir 110 Effectene l (Tabla II). </li></ol></li><li> Llevar a cada tubo a un volumen final de 1000 l mediante la adición de los medios de comunicación calentado gota a gota a la mezcla de ADN / buffer / Enhancer / Effectene. ADN puede precipitar en este momento si los medios de comunicación se añade demasiado rápido. Mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces. <ol class="lalpha"><li> Por un plásmido de ADN l, añadir los medios de comunicación 882 l (tabla I). </li><li> Por un pGFP l, añadir los medios de comunicación 882 l (Tabla II). </li><li> Por un pBFP l, añadir los medios de comunicación 882 l (Tabla II). </li><li> Por un pBFP l y l 1 ON, añadir 864 medios de comunicación l (Tabla II). </li><li> Por un pBFP l y l 5 ON, añadir 792 medios de comunicación l (Tabla II). </li><li> Por un pBFP l l 10 y ON, añadir los medios de comunicación 702 l (Tabla II). </li></ol></li><li> A continuación se añade lentamente 1 ml de la correspondiente ADN / Enhancer / Effectene mezcla a cada pocillo una gota a la vez. </li><li> Agitar la placa suavemente para asegurar la distribución uniforme de las células y la mezcla de transfección. Incubatlas células e bajo condiciones normales de crecimiento. </li><li> Un día después de la transfección, suavemente aspire a sustituir a los medios de comunicación y poco a poco, con un volumen equivalente de los medios de comunicación recién calentado. Es importante no perturbar las capas de células en la parte inferior de los pozos cuando se hace esto. </li><li> Dos días después de la transfección examinar las células positivas de control transfectadas con pGFP bajo microscopio de fluorescencia para determinar la eficiencia de transfección (Figura 2). </li><li> SUA5B células crecen muy rápidamente y se convertirá en maleza. Cuatro días después de la transfección de estas células delgadas aspirando a los medios de comunicación antiguos y agregar poco a poco un volumen equivalente de los medios de comunicación recién calentado. </li><li> Después de la adición de nuevos medios de comunicación a los pozos, desmonte todas las células de la parte inferior de cada pozo pipeta de arriba a abajo, descartar la mitad del volumen (1 ml) de la mezcla de células y agregar 1 ml de agua dulce caliente medios para llevar el volumen final a 2 mL. </li><li> Revisar las células diariamente para asegurarse de que están sanos y no cubierto, fina como sea necesario. </li><li> Permiten que las células crezcan en condiciones normales de cinco a siete días antes de la transfección a su recogida para su análisis. </li><li> De cinco a siete días después de la transfección, recoger las células mediante la aspiración de los viejos medios en todos los pozos y la adición de 1 ml de PBS estéril a temperatura ambiente a cada pocillo. </li><li> Separar las células de la parte inferior del pozo pipeteando arriba y hacia abajo y la transferencia de mezcla de células de 5 tubos con tapa de presión ml y de inmediato analizar las células mediante citometría de flujo. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A. untransfected saludable stephensi MSQ43 (A) y A. gambiae SUA5B (B) las células en la confluencia de aproximadamente 80%. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. A. stephensi MSQ43 (A) y A. gambiae SUA5B (B) las células transfectadas con GFP control positivo expresar plásmido. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Citometría de flujo de datos que confirma la conversión de BFP a las buenas prácticas agrarias a través de la mutagénesis de un solo nucleótido siguientes transfección con BFP específicas de ácido nucleico cerrado-oligonucleótidos modificados (LNA-ons). SUA5B células fueron transfectadas con un plásmido que expresa GFP (pGFP) como control positivo, con un plásmido que expresa BFP (pBFP) como control negativo, o con pBFP y concentraciones crecientes de BFP específicos LNA-ons. (A) de apertura de puerta estrategia para los datos de citometría de flujo que muestra de izquierda a derecha: dispersión frontal contra lado de las células vivas, yoduro de propidio (PI), las células negativas, y las células GFP positivos cinco días después de la transfección. (B) Gráfico de porcentaje de células positivas GFP se muestra en (A) transfección siguientes pBFP y concentraciones crecientes de LNA-ons. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table1.jpg" alt="Tabla 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabla 1"> Tabla I. condiciones de transfección. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table2.jpg" alt="Tabla 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabla 2"> Tabla II. Condiciones de transfección utilizado en la Figura 1.

<ol><li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid+%28LNA%29%3A+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li>
<li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li>
<li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li>
<li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li>
<li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li>
<li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li>
<li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li>
<li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li>
<li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li>
</ol>

Aquí presentamos un método in vitro y las pruebas para la conversión selectiva de un solo nucleótido en el gen episomal un objetivo después de la transfección de LNA-Ons en A. stephensi y A. gambiae células. LNA-ON mediada por la conversión de genes requiere la inducción de un sitio específico de la respuesta de reparación del ADN, nuestros datos indican que las células de mosquito puede apoyar este mecanismo de mutagénesis sitio-específica. Mientras que el método que aquí se presenta...

<table><tbody><tr><td>Reactivo de transfección Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido control GFP (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td><td>Invitrogen</td><td>K4935-00</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido BFP (pcDNA5/FRT/TO)</td><td></td><td></td><td>Donado por el Dr. Concordet&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>ONs con anclaje de ácido nucleico bloqueado (LNA-ONs)</td><td></td><td></td><td>Donado por el Dr. Concordet&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>MEM, Earle&amp;rsquo;s con glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>11095</td><td></td></tr><tr><td>Suero de ternera fetal (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Medio &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; de Schneider&amp;rsquo;s</td><td>Invitrogen</td><td>11730</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa al 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

transfección y mutagénesis de los genes diana en células de mosquito por nucleico cerrado modificado ácido oligonucleótidos

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Parásitos Plasmodium, el agente causante de la malaria, se transmite por la picadura de mosquitos anofeles infectados que resulta en más de 250 millones de nuevas infecciones cada año. A pesar de décadas de investigación, aún no existe una vacuna contra la malaria, destacando la necesidad de estrategias de control de la novela. Un enfoque innovador es el uso de mosquitos genéticamente modificados para controlar de forma efectiva la transmisión de parásitos de malaria. Alteraciones deliberadas de vías de señalización celular en el mosquito, a través de mutagénesis dirigida, se han encontrado para regular el desarrollo del parásito 1. A partir de estos estudios, podemos empezar a identificar posibles objetivos para la transformación genética. Mutagénesis dirigida se ha basado tradicionalmente en la recombinación homóloga entre un gen diana y una molécula de ADN de gran tamaño. Sin embargo, la construcción y el uso de tales moléculas de ADN complejo para la generación de líneas celulares transformadas de forma estable es costoso, lento y con frecuencia ineficientes. Por lo tanto, una estrategia de uso de ácido nucleico cerrado modificado-oligonucleótidos (LNA-ons) ofrece una alternativa útil para la introducción artificial sustituciones de un solo nucleótido en el gen episomal objetivos y ADN cromosómico (revisado en 2). LNA-ON mediada por mutagénesis dirigida se ha utilizado para introducir mutaciones puntuales en genes de interés en cultivos de células de levadura y 3,4 ratones. Mostramos aquí que LNA complementos pueden ser utilizados para introducir un cambio de nucleótido único en un objetivo episomal transfectadas que se traduce en un cambio de la proteína fluorescente azul (BFP) expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) de expresión, tanto en Anopheles gambiae y Anopheles stephensi células . Esta conversión se demuestra por primera vez que la mutagénesis eficaz de los genes diana en las células de mosquito puede estar mediado por LNA-ons y sugiere que esta técnica puede ser aplicable a la mutagénesis de los objetivos cromosómicas in vitro e in vivo.

Oligonucleótidos se puede utilizar para sustituir a un sitio concreto de un solo nucleótido de los genes diana transfectadas en ambos<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Y<em&gt; Anopheles stephensi</em&gt; Células.

Transfección y mutagénesis de los genes diana en células de mosquito por nucleico cerrado modificado ácido oligonucleótidos

Los parásitos del género Plasmodium, agentes causantes de la malaria, se transmiten a través de las picaduras de mosquitos Anopheles infectados, lo que resulta en más de 250 millones de nuevos...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una estrategia novedosa para la mutagénesis dirigida a un sitio específico en células de mosquito con anomalías. Esto se logra primero preparando células cultivadas sanas para la transfección. Luego, las células se transfectan con los ADN de control y de prueba apropiados mediante la adición de reactivos de transfección.El siguiente paso del procedimiento consiste en monitorear las células de control para detectar fluorescencia y reducir la densidad de las células experimentales. Finalmente, las frecuencias de conversión génica pueden determinarse en las células experimentales mediante citometría de flujo a los cinco a siete días posteriores a la transfección. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la mutagénesis dirigida a un sitio diana en un gen episomal mediante la reparación del ADN inducida por oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueado.Hola, soy la Dra. Nazy Pacor del laboratorio de la Dra. Shirley Lockhart en el Departamento de Microbiología Médica e Inmunología de la Universidad de California Davis. Hoy les mostraremos un procedimiento novedoso para la mutagénesis dirigida a sitio en células de mosquitos anomalias. Utilizamos este procedimiento para estudiar la función de los genes de respuesta inmune innata de los mosquitos mediante mutagénesis dirigida a sitio.Así que comencemos. Antes de iniciar el protocolo, obtenga células de mosquito que estén sanas y tengan una confluencia aproximada del 80 %. Si las células son adherentes, excesivamente crecidas o no están sanas, se obtendrá una baja eficiencia de transfección y resultados inconsistentes.Este protocolo se demuestra con células B ananais Gambier SUA cinco. Sin embargo, también se pueden utilizar células Ananais ensi MS Q4 tres. Comience la preparación de la transfección calentando el medio S dos en un baño de agua a 28 grados Celsius durante 30 minutos.Coloque todos los materiales del reactivo de transfección, el plásmido y los oligonucleótidos en hielo. Utilizando técnica estéril en una cabina de cultivo de tejidos, aspire el medio antiguo sin perturbar las células y reemplácelo por un volumen equivalente de medio fresco precalentado, y enjuague las células del fondo del frasco. Usando una pipeta, se debe determinar la concentración de células y ajustarla a una concentración final de uno por diez elevado a seis células por mililitro.Una vez que se haya ajustado la concentración final, añada un mililitro de células de mosquito a cada pocillo de una placa de seis pocillos. Mientras se preparan los materiales del reactivo de transfección, las placas con células pueden mantenerse a temperatura ambiente; transfiera el ADN plasmídico a tubos estériles de microcentrífuga. Aquí se utiliza un plásmido que expresa la proteína verde fluorescente como control positivo y un plásmido que expresa la proteína azul fluorescente como control negativo.El ADN de prueba también incluye el plásmido que expresa BFP, pero con concentraciones crecientes de ácido nucleico bloqueado (LNA) específico para BFP, oligonucleótidos modificados o LNA os. Después de que el ADN haya sido aliquotado, añada 99 microlitros de tampón kage y EC por cada microgramo de ADN plasmídico y L-N-A-O-N. Luego, añada lentamente ocho microlitros de potenciador por cada microgramo de ADN utilizado, y vortexee la mezcla de tampón de ADN y potenciador.Durante un segundo, centrifugar brevemente la solución para reunirla en el fondo de los tubos e incubar las muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos. Añadir 10 microlitros de reactivo activador por cada microgramo de ADN plasmático y mezclar mediante vortex durante 10 segundos. Centrifugar brevemente la solución hacia el fondo de los tubos y luego incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras la incubación, llevar el volumen final de cada tubo a 1000 microlitros añadiendo lentamente medio tibio al mezcla de potenciador del tampón de ADN. En este punto, el ADN puede precipitarse si el medio se añade demasiado rápido; mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces.Finalmente, agregue lentamente un mililitro de la mezcla adecuada de potenciador de ADN a cada pocillo de células. Una gota a la vez. Agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las células y de la mezcla de transfección.Incube las células bajo condiciones normales de crecimiento un día después de la transfección, aspire suavemente el medio de las células y reemplácelo lentamente con un volumen equivalente de medio fresco y precalentado. Tenga cuidado de no perturbar las capas celulares en el fondo de las placas. Dos días después de la transfección, examine las células de control positivo transfectadas con un plásmido que expresa GFP bajo un microscopio de fluorescencia para determinar la eficiencia de transfección.Cuatro días después de la transfección s uua, es necesario diluir cinco células B, ya que crecen muy rápidamente y pueden sobrecrecerse. Para ello, aspire el medio antiguo de las células y agregue lentamente un volumen equivalente de medio fresco y precalentado. Después de añadir el nuevo medio a los pocillos, desprenda todas las células del fondo de cada pocillo pipeteando hacia arriba y hacia abajo, deseche la mitad del volumen de la mezcla celular y agregue un mililitro de medio fresco y precalentado para llevar el volumen final a dos mililitros.Revise las células diariamente para asegurarse de que estén sanas y no estén demasiado crecidas. Rebájelas según sea necesario. Permita que las células crezcan en condiciones normales durante cinco a siete días posteriores a la transfección antes de recolectarlas para su análisis.A los cinco o siete días posteriores a la transfección, recolecte las células aspirando el medio antiguo de las células y agregando un mililitro de PBS estéril a temperatura ambiente a cada una. Desprenda las células del fondo de cada pocillo pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Finalmente, transfiera la mezcla celular a tubos de tapa roscada de cinco mililitros y analice inmediatamente las células mediante citometría de flujo.Un ojo de defensa. Las células MS Q4 tres y una UA de gambier cinco B fueron transfectadas con un plásmido positivo de control que expresa GFP. Las células se muestran mediante microscopía de luz y fluorescencia, y como muestra la imagen, los datos de citometría de flujo confirman la conversión de BFP a GFP mediante la mutagénesis de un solo nucleótido tras la transfección con LNAO Ns específicos para BFP. Las células UA cinco B fueron transfectadas con el plásmido que expresa GFP como control positivo, con un plásmido que expresa BFP como control negativo, o con el plásmido que expresa BFP y concentraciones crecientes de LNAO Ns específicos para BFP.La estrategia de selección para los datos de citometría de flujo muestra la dispersión directa frente a la dispersión lateral de células viables, células negativas para yoduro de propidio y células positivas para GFP cinco días después de la transfección; el porcentaje de células positivas para GFP tras la transfección con un plásmido que expresa BFP y concentraciones crecientes de LNAO NS se puede observar aquí en forma gráfica, confirmando la conversión de BFP a GFP por L aos. Acabamos de mostrarle un procedimiento novedoso para la mutagénesis dirigida a sitio de anomalías en células de mosquito. Al realizar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que sus células estén sanas y en la densidad adecuada antes de la transfección.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Inmunología e Infección

Aquí se describe un procedimiento para inhibir la función génica en los mosquitos vectores de enfermedades mediante el uso de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que son ingeridas por las larvas.

El quitosano / ARN de interferencia mediada por nanopartículas silenciamiento génico en la enfermedad vectorial larvas de mosquitos

La interferencia de ARN (ARNi) es una herramienta extremadamente valiosa para descubrir la función de los genes. Sin embargo, la capacidad de dirigirse a genes utilizando ARNi durante las etapas preadultas es limitada en el principal vector de la malaria humana, Anopheles gambiae. Describimos un protocolo de ARNi para reducir la función génica mediante inyección directa durante el desarrollo de la pupa.

RNAi gatillo en la entrega<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Las pupas

Nos informe utilizando una artificial pequeño intronic RNA expresión estrategia para desarrollar un recombinante defectuoso no Aedes aegypti densovirus (AaeDV) en vivo el sistema de entrega. Se describe un procedimiento detallado para la construcción, envases y análisis cuantitativo de los vectores rAaeDV, así como por infección larval.

Uso de un Mosquito recombinante Densovirus como un Vector de la entrega de genes para el análisis funcional de Genes en larvas de mosquitos

Este protocolo describe procedimientos de microinyección para embriones de Culex quinquefasciatus que están optimizados para trabajar con herramientas de edición de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica puede generar de manera eficiente mutaciones de la línea germinal heredables y específicas del sitio que se pueden usar para construir tecnologías genéticas en este vector de enfermedad poco estudiado.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 se utiliza cada vez más para caracterizar la función génica en organismos no modelo. Este protocolo describe cómo generar líneas eliminatorias de Culex pipiens,desde la preparación de mezclas de inyección, hasta la obtención e inyección de embriones de mosquitos, así como la forma de criar, cruzar y detectar mosquitos inyectados y su progenie para detectar mutaciones deseadas.

Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR/Cas9

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil para la modificación de la expresión génica de forma espaciotemporal controlada que permite el análisis genético funcional en Anopheles gambiae. Los procedimientos descritos para el uso de este sistema son una estrategia de clonación semi-estandarizada, sexado y cribado de pupas para marcadores de proteínas fluorescentes y fijación embrionaria.

Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae

El protocolo describe cómo lograr modificaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos de la malaria Anopheles utilizando el sistema φC31 . Las modificaciones descritas incluyen tanto la integración como el intercambio de casetes transgénicos en el genoma de las líneas de acoplamiento que llevan attP.

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

Los protocolos reportados aquí ilustran tres formas alternativas de evaluar el rendimiento de los mosquitos genéticamente modificados destinados al control de vectores en ensayos de jaulas pequeñas contenidos en laboratorio. Cada protocolo se adapta a la modificación específica que tiene la cepa del mosquito (impulsor genético o no impulsor genético) y los tipos de parámetros medidos.

Ensayos de laboratorio en jaulas pequeñas de mosquitos anofelinos genéticamente modificados

Este artículo detalla un protocolo para la identificación rápida de indels inducidos por CRISPR/Cas9 y la selección de líneas mutantes en el mosquito Aedes aegypti utilizando análisis de fusión de alta resolución.

Detección indel tras mutagénesis CRISPR/Cas9 mediante análisis de fusión de alta resolución en el mosquito Aedes aegypti

La administración oral de dsRNA producido por bacterias, un método de administración para la interferencia de ARN (RNAi) que se usa rutinariamente en Caenorhabditis elegans, se aplicó con éxito aquí a mosquitos adultos. Nuestro método permite estudios robustos de genética inversa y estudios de vectores que bloquean la transmisión sin el uso de inyección.

Administración efectiva de ARN oral de interferencia (ARNi) a mosquitos adultos Anopheles gambiae

En este trabajo describimos un protocolo detallado para la edición del genoma mediante microinyección embrionaria en el mosquito A. aegypti utilizando la tecnología CRISPR-Cas9.

Edición del genoma del mosquito Aedes aegypti de la fiebre amarilla mediante CRISPR-Cas9

Aprende mutagénesis dirigida en células de mosquito Anopheles usando oligonucleótidos de ácido nucleico cerrado. Este método permite la edición precisa de genes para estudios de biología de vectores y control de enfermedades.

Transfección y mutagénesis de los genes diana en células de mosquito por nucleico cerrado modificado ácido oligonucleótidos

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