Péptidos de la Biblioteca de Phage Display modular la expresión génica en las células mesenquimales y potenciar la osteogénesis en defectos óseos unicorticales

El objetivo general de este experimento es identificar secuencias que potencien la diferenciación de células mesenquimales y promuevan la reparación ósea. El primer paso consiste en aislar mediante biopanning el fago que se une al hueso. Luego, proceda a identificar las secuencias de péptidos que se unen a las células mesenquimales y también determine los cambios subsiguientes en la expresión génica.

Realice experimentos para determinar cómo se pueden entregar las secuencias peptídicas al hueso con fines regenerativos. Como paso final, examine histológicamente la reparación ósea; en conjunto, los resultados pueden ofrecer información importante sobre los mecanismos de diferenciación celular in vitro y la reparación ósea in vivo. Las ventajas de utilizar la técnica de biopanning con una biblioteca de presentación en fagos son que pudimos identificar péptidos que se dirigen al hueso y que pueden usarse para estimular la diferenciación de células mesenquimales y potenciar la reparación ósea.

En última instancia, estas secuencias peptídicas podrían ser útiles en modalidades terapéuticas para la reparación ósea y para el tratamiento de la pérdida ósea, como la osteopenia y la osteoporosis. Basándonos en un estudio en el que ULA y Pascal demostraron que el biotamizado puede utilizarse para aislar secuencias peptídicas que se dirigen a los vasos sanguíneos, optamos por adaptar este método para investigar mecanismos en el hueso. Para el procedimiento de biotamizado in vivo, se perfundieron 10 veces 10 a la 10ª unidades formadoras de placas de la biblioteca de presentación de péptidos en fagos N-E-B-P-H-D 12 a través del corazón de un ratón C de 10 semanas de edad.

Después de aproximadamente cinco minutos, sacrificar al ratón, exponer y diseccionar los fémures, cortar los extremos y extraer la médula ósea. Enjuagar el fémur izquierdo tanto por dentro como por fuera con PBS 10 veces. Luego añadir el hueso a las bacterias ER 2 5 3 7.

Para eliminar el fago no unido, utilice leche descremada seca al 2 % en una jeringa con aguja de calibre 21 para enjuagar el canal intermedio del fémur derecho 10 veces. Ahora, eluya el fago unido del canal intermedio con tampón de glicina ácido clorhídrico, pH 2,2, neutralizado con un mol de tris.

Para amplificar el fago, añada EIT a bacterias ER 2 5 3 7 y cultive durante 4,5 horas. Transfiera cuidadosamente los sobrenadantes a tubos nuevos y precipite el fago tres veces mediante la adición de polietilenglicol. Solución de cloruro de sodio, incube los tubos durante la noche a cuatro grados Celsius.

Finalmente, re suspenda el sedimento en TBS con azida de sodio al 0,02%. Plaque el fago en placas para determinar las unidades formadoras de placa de los EIT amplificados. Repita el procedimiento de biopanning in vivo para el fago eluido y no eluido cuatro veces.

Amplifique el fago agrupado en cultivos bacterianos. Purifique y cuantifique la secuencia de ADN, el ADN final del fago, utilizando el cebador 98 proporcionado con el kit de exhibición de fagos. Es importante calcular la frecuencia de representación de la secuencia de ADN del fago.

Ahora sintetice péptidos que incorporen una secuencia semilla de glicina-glicina-glicina lisina y amplifique células D uno. Una línea celular clonada de células estromales de médula ósea multipotenciales de ratón que se desarrolló en nuestro laboratorio al 90 % de confluencia. Use tripsina en las células, centrifugue para formar el pellet y cuente para sembrar células en placas para tinción sobre portaobjetos con cámara recubiertos con gelatina y cultive durante 24 horas.

Lave las células con PBS y fíjelas con paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos. A continuación, realice incubaciones de bloqueo con glicina seguidas de Aden BSA y BBSA. Soluciones de bloqueo de biotina.

Añada 100 micromolar de péptidos biotinilados L siete y R uno. Proceda a lavar las células tres veces con PBS durante cinco minutos cada vez. Añada una dilución uno a 1000 de LOR strippin, cúbralo y envuélvalo en papel de aluminio, e incube en un cajón oscuro durante 30 minutos.

Lave las células y monte las laminillas con medio de montaje Vector Shield. A continuación, analice las preparaciones bajo un microscopio de fluorescencia 24 horas antes de la cirugía. Sumerja los cilindros de espuma de gel.

Transfiera los cilindros de espuma de gel con péptido a una concentración de 20 micromolar, ya sea L siete o R uno, o tampón PBS sin péptido, a placas de cultivo estériles de 12 pocillos y refrigérelos durante la noche a cuatro grados Celsius en el momento de la cirugía. Coloque el compuesto de espuma de gel sobre hielo hasta su uso.

Utilizando una fresa neumática bajo irrigación con solución salina, cree un defecto unicotical oblongo grande de tres milímetros de ancho por ocho milímetros de largo. Trate el defecto óseo con esponjas de gel preparadas insertando todos los andamios implantados mediante golpes suaves. Sacrifique a las ratas y recoja las tibias en puntos de tiempo definidos; verifique cuidadosamente el defecto óseo y fije las tibias recolectadas en formalina tamponada neutra al 10 % para su inclusión en parafina.

Finalmente, tiña todas las secciones de tejido con hematoxilina y eosina para marcar la matriz ósea. La adenina marcada con isotiocianato de fluoresceína permite la detección microscópica de la unión de péptidos a células cultivadas in vitro. Aquí, los péptidos se unen a células mesenquimales en cultivo para determinar el efecto osteogénico de los péptidos sobre las células.

Las células mesenquimales cultivadas in vitro pueden tratarse con péptidos de prueba para determinar cambios en la morfología celular. Por ejemplo, al cuarto día, las células comienzan a agregarse y los agregados aumentan de tamaño con el tiempo para formar nódulos. Curiosamente, la sección ósea teñida con h y e muestra autofluorescencia bajo luz ultravioleta.

Este mayor contraste entre los tejidos óseos y no óseos facilita los análisis para cuantificar la presencia de hueso en las secciones y determinar la reparación ósea en los defectos tratados con gelfoam más péptido. En comparación con el gelfoam solo aquí, los defectos que se rellenaron con más péptido mostraron la mayor cantidad de reparación cortical con el tiempo mientras se intentaba este procedimiento. Es importante ser extremadamente metódico en el ingreso de datos debido al gran número de especímenes que inevitablemente se acumularán con el tiempo hasta que haya seleccionado el grupo final de péptidos.

El desarrollo del biopanning in vivo como técnica para identificar péptidos que se dirigen al hueso implica que ahora contamos con fármacos potenciales que podrían utilizarse como terapia para la reparación ósea y para la pérdida ósea. Uno de los mecanismos que subyacen a la reparación ósea también está implicado en la pérdida ósea. Comprender estos mecanismos con mayor detalle y disponer de herramientas que podrían emplearse para el tratamiento de trastornos como fracturas retrasadas y osteoporosis ayudará a mejorar las terapias que pueden diseñarse para la atención sanitaria.