Name: Péptidos de la Biblioteca de Phage Display modular la expresión génica en las células mesenquimales y potenciar la osteogénesis en defectos óseos unicorticales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprende a identificar péptidos mediante biopanning in vivo con biblioteca de phage display para modular la expresión génica en células mesenquimales y potenciar la reparación ósea en defectos unicorticales.

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<li>Santos, J. L., Pandita, D., Rodrigues, J., Pêgo, A. P., Granja, P. L., Tomás, H., Balian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-Mediated+Gene+Delivery+in+Mesenchymal+Stem+Cells+using+PAMAM+Dendrimers+conjugated+with+Osteotropic+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Receptor-Mediated Gene Delivery in Mesenchymal Stem Cells using PAMAM Dendrimers conjugated with Osteotropic Peptides.</a> Molecular Pharmaceutics. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

La producción de este video fue patrocinado por New England Biolabs, Inc, que produce algunos de los reactivos utilizados en este artículo.

<table><tbody><tr><td>Kit de biblioteca de péptidos con presentación mediante fagos - Ph.D-12</td><td>New England Biolabs</td><td>E8110S</td><td></td></tr></tbody></table>

péptidos de la biblioteca de phage display modular la expresión génica en las células mesenquimales y potenciar la osteogénesis en defectos óseos unicorticales

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Dos péptidos sintéticos novedosos acelerar la formación de hueso y se puede entregar con una matriz de colágeno. El objetivo de este estudio fue investigar los efectos de la reparación ósea en un modelo de defecto unicortical. Tratamiento de las células mesenquimales producido un aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina, mostró la formación de nódulos en las células, y el aumento de la expresión de genes de Runx2, osterix, sialoproteína ósea y osteocalcina. Una esponja empapada con la reparación del colágeno péptido promovido de defectos óseos, mientras que el control era menos eficaz. Los resultados de este estudio demostraron que las células mesenquimales tratados con el péptido in vitro se diferencian hacia la osteogénesis y, que los péptidos entrega en vivo con una esponja de colágeno promover la reparación de defectos unicortical.

Una biblioteca de fagos se utilizó para identificar las secuencias de péptidos de que el hueso blanco. El objetivo fue investigar el efecto de estos péptidos en la diferenciación de células mesenquimales y para determinar su efecto sobre la regeneración ósea.

Péptidos de la Biblioteca de Phage Display modular la expresión génica en las células mesenquimales y potenciar la osteogénesis en defectos óseos unicorticales

Dos nuevos péptidos sintéticos aceleran la formación ósea y pueden administrarse mediante una matriz de colágeno. El objetivo de este estudio fue investigar los efectos...

El objetivo general de este experimento es identificar secuencias que potencien la diferenciación de células mesenquimales y promuevan la reparación ósea. El primer paso consiste en aislar mediante biopanning el fago que se une al hueso. Luego, proceda a identificar las secuencias de péptidos que se unen a las células mesenquimales y también determine los cambios subsiguientes en la expresión génica.Realice experimentos para determinar cómo se pueden entregar las secuencias peptídicas al hueso con fines regenerativos. Como paso final, examine histológicamente la reparación ósea; en conjunto, los resultados pueden ofrecer información importante sobre los mecanismos de diferenciación celular in vitro y la reparación ósea in vivo. Las ventajas de utilizar la técnica de biopanning con una biblioteca de presentación en fagos son que pudimos identificar péptidos que se dirigen al hueso y que pueden usarse para estimular la diferenciación de células mesenquimales y potenciar la reparación ósea.En última instancia, estas secuencias peptídicas podrían ser útiles en modalidades terapéuticas para la reparación ósea y para el tratamiento de la pérdida ósea, como la osteopenia y la osteoporosis. Basándonos en un estudio en el que ULA y Pascal demostraron que el biotamizado puede utilizarse para aislar secuencias peptídicas que se dirigen a los vasos sanguíneos, optamos por adaptar este método para investigar mecanismos en el hueso. Para el procedimiento de biotamizado in vivo, se perfundieron 10 veces 10 a la 10ª unidades formadoras de placas de la biblioteca de presentación de péptidos en fagos N-E-B-P-H-D 12 a través del corazón de un ratón C de 10 semanas de edad.Después de aproximadamente cinco minutos, sacrificar al ratón, exponer y diseccionar los fémures, cortar los extremos y extraer la médula ósea. Enjuagar el fémur izquierdo tanto por dentro como por fuera con PBS 10 veces. Luego añadir el hueso a las bacterias ER 2 5 3 7.Para eliminar el fago no unido, utilice leche descremada seca al 2 % en una jeringa con aguja de calibre 21 para enjuagar el canal intermedio del fémur derecho 10 veces. Ahora, eluya el fago unido del canal intermedio con tampón de glicina ácido clorhídrico, pH 2,2, neutralizado con un mol de tris.Para amplificar el fago, añada EIT a bacterias ER 2 5 3 7 y cultive durante 4,5 horas. Transfiera cuidadosamente los sobrenadantes a tubos nuevos y precipite el fago tres veces mediante la adición de polietilenglicol. Solución de cloruro de sodio, incube los tubos durante la noche a cuatro grados Celsius.Finalmente, re suspenda el sedimento en TBS con azida de sodio al 0,02%. Plaque el fago en placas para determinar las unidades formadoras de placa de los EIT amplificados. Repita el procedimiento de biopanning in vivo para el fago eluido y no eluido cuatro veces.Amplifique el fago agrupado en cultivos bacterianos. Purifique y cuantifique la secuencia de ADN, el ADN final del fago, utilizando el cebador 98 proporcionado con el kit de exhibición de fagos. Es importante calcular la frecuencia de representación de la secuencia de ADN del fago.Ahora sintetice péptidos que incorporen una secuencia semilla de glicina-glicina-glicina lisina y amplifique células D uno. Una línea celular clonada de células estromales de médula ósea multipotenciales de ratón que se desarrolló en nuestro laboratorio al 90 % de confluencia. Use tripsina en las células, centrifugue para formar el pellet y cuente para sembrar células en placas para tinción sobre portaobjetos con cámara recubiertos con gelatina y cultive durante 24 horas.Lave las células con PBS y fíjelas con paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos. A continuación, realice incubaciones de bloqueo con glicina seguidas de Aden BSA y BBSA. Soluciones de bloqueo de biotina.Añada 100 micromolar de péptidos biotinilados L siete y R uno. Proceda a lavar las células tres veces con PBS durante cinco minutos cada vez. Añada una dilución uno a 1000 de LOR strippin, cúbralo y envuélvalo en papel de aluminio, e incube en un cajón oscuro durante 30 minutos.Lave las células y monte las laminillas con medio de montaje Vector Shield. A continuación, analice las preparaciones bajo un microscopio de fluorescencia 24 horas antes de la cirugía. Sumerja los cilindros de espuma de gel.Transfiera los cilindros de espuma de gel con péptido a una concentración de 20 micromolar, ya sea L siete o R uno, o tampón PBS sin péptido, a placas de cultivo estériles de 12 pocillos y refrigérelos durante la noche a cuatro grados Celsius en el momento de la cirugía. Coloque el compuesto de espuma de gel sobre hielo hasta su uso.Utilizando una fresa neumática bajo irrigación con solución salina, cree un defecto unicotical oblongo grande de tres milímetros de ancho por ocho milímetros de largo. Trate el defecto óseo con esponjas de gel preparadas insertando todos los andamios implantados mediante golpes suaves. Sacrifique a las ratas y recoja las tibias en puntos de tiempo definidos; verifique cuidadosamente el defecto óseo y fije las tibias recolectadas en formalina tamponada neutra al 10 % para su inclusión en parafina.Finalmente, tiña todas las secciones de tejido con hematoxilina y eosina para marcar la matriz ósea. La adenina marcada con isotiocianato de fluoresceína permite la detección microscópica de la unión de péptidos a células cultivadas in vitro. Aquí, los péptidos se unen a células mesenquimales en cultivo para determinar el efecto osteogénico de los péptidos sobre las células.Las células mesenquimales cultivadas in vitro pueden tratarse con péptidos de prueba para determinar cambios en la morfología celular. Por ejemplo, al cuarto día, las células comienzan a agregarse y los agregados aumentan de tamaño con el tiempo para formar nódulos. Curiosamente, la sección ósea teñida con h y e muestra autofluorescencia bajo luz ultravioleta.Este mayor contraste entre los tejidos óseos y no óseos facilita los análisis para cuantificar la presencia de hueso en las secciones y determinar la reparación ósea en los defectos tratados con gelfoam más péptido. En comparación con el gelfoam solo aquí, los defectos que se rellenaron con más péptido mostraron la mayor cantidad de reparación cortical con el tiempo mientras se intentaba este procedimiento. Es importante ser extremadamente metódico en el ingreso de datos debido al gran número de especímenes que inevitablemente se acumularán con el tiempo hasta que haya seleccionado el grupo final de péptidos.El desarrollo del biopanning in vivo como técnica para identificar péptidos que se dirigen al hueso implica que ahora contamos con fármacos potenciales que podrían utilizarse como terapia para la reparación ósea y para la pérdida ósea. Uno de los mecanismos que subyacen a la reparación ósea también está implicado en la pérdida ósea. Comprender estos mecanismos con mayor detalle y disponer de herramientas que podrían emplearse para el tratamiento de trastornos como fracturas retrasadas y osteoporosis ayudará a mejorar las terapias que pueden diseñarse para la atención sanitaria.

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Investigación

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Biology

Biología

La diferenciación de las células precursoras en osteoclastos está regulada por citocinas y factores de crecimiento. En este trabajo se describe una nueva técnica de transferencia génica para la diferenciación de osteoclastos in vivo y protocolos de cultivo celular para diferenciar células precursoras en osteoclastos in vitro como método para estudiar los efectos de las citocinas en la osteoclastogénesis.

A Novel In vivo Técnica de transferencia de genes y In vitro ensayos basados ​​en células para el estudio de la pérdida ósea en los trastornos musculoesqueléticos

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar la formación de vasos sanguíneos en vivo y en tiempo real en 3D andamios por microscopía multifotón. Angiogénesis en andamios modificados genéticamente fue estudiada en un modelo de defecto murino hueso calvarial de crítica. Más nuevos vasos sanguíneos fueron detectados en el grupo de tratamiento que en los controles.

Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

Biomateriales dopados con hueso Morphogenetic Protein 2 (BMP2) se han utilizado como una nueva estrategia terapéutica para sanar fracturas sin unión. Para superar los efectos secundarios resultantes de una liberación incontrolable del factor, proponemos una nueva estrategia para sitio-directamente inmovilizar el factor, creando materiales con mayor capacidad osteogénica.

Dirigida la inmovilización de la proteína ósea morfogenética 2 a superficies sólidas por química del tecleo

Presentamos un protocolo para investigar los biomarcadores de la expresión de mRNA de células derivadas del periostio (PDC) inducidas por la vitamina C (vitamina C) y 1, 25-dihidroxi vitamina D [1,25-(OH) D23]. Además, evaluamos la capacidad de PDC se diferencian en osteocitos, condrocitos y adipocitos.

Aislamiento de células madre mesenquimatosas del periostio Alveolar humano y efectos de la vitamina D en la actividad osteogénica de células derivadas del periostio

Presentamos un protocolo para comparar el estado de los minerales en vesículas por dos líneas de células de hueso humano: hFOB 1.19 y Saos-2. Sus perfiles de mineralización fueron analizados por alizarina rojo-S (AR-S) coloración, visualización luz de ultravioleta (UV), la proyección de imagen de microscopía electrónica (TEM) transmisión y microanálisis por energía dispersiva por rayos x (EDX).

Análisis de minerales producidos por hFOB 1.19 y Saos-2 células usando la microscopia electrónica transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía

En este documento, presentamos un protocolo detallado para la detección de pequeños péptidos que se unen a FGFR2 utilizando una biblioteca de péptidos de visualización de fagos. Analizamos más a fondo la afinidad de los péptidos seleccionados hacia FGFR2 in vitro y su capacidad para suprimir la proliferación celular.

Detección e identificación de pequeños péptidos dirigidos al receptor de factor de crecimiento de fibroblastos2 utilizando una biblioteca de péptidos de pantalla de fago

Este protocolo describe la microdisección de captura láser para el aislamiento del cartílago y el hueso de las secciones congeladas frescas del embrión del ratón. El cartílago y el hueso se pueden visualizar rápidamente mediante la tinción violeta de cresíl y se recogen con precisión para producir ARN de alta calidad para el análisis transcriptómico.

Microdisección de captura láser de cartílago embrionario de ratón y hueso para análisis de expresión génica

Este protocolo describe un método canónico para entender los genes críticos que controlan la actividad osteoclasta in vivo. Este método utiliza un modelo de ratón transgénico y algunas técnicas canónicas para analizar el fenotipo esquelético.

Análisis de fenotipo esquelético de un modelo de ratón de eliminación condicional de Stat3

La ubiquitinación es una proteína crítica de modificación post-traduccional, cuya desregulación se ha implicado en numerosas enfermedades humanas. Este protocolo detalla cómo se puede utilizar la visualización de fagos para aislar nuevas variantes de ubiquitina que pueden unirse y modular la actividad de las ligasas E3 que controlan la especificidad, la eficiencia y los patrones de ubiquitinación.

Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3

El protocolo presenta un método para aislar lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de embriones de ratón disecados o células mesenquimas palatales embrionarias de ratón cultivadas y realizar posterior western blotting para evaluar los niveles de proteína fosforilada.

Aislamiento de lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y células mesenquimas palatinas cultivadas para el análisis de fosfoproteínas

Aprende a identificar péptidos mediante biopanning in vivo con biblioteca de phage display para modular la expresión génica en células mesenquimales y potenciar la reparación ósea en defectos unicorticales.

Péptidos de la Biblioteca de Phage Display modular la expresión génica en las células mesenquimales y potenciar la osteogénesis en defectos óseos unicorticales (Video) | JoVE Journal

Péptidos de la Biblioteca de Phage Display modular la expresión génica en las células mesenquimales y potenciar la osteogénesis en defectos óseos unicorticales

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