Péptidos de la Biblioteca de Phage Display modular la expresión génica en las células mesenquimales y potenciar la osteogénesis en defectos óseos unicorticales

El objetivo general de este experimento es identificar secuencias que potencien la diferenciación de las células mesenquimales y promuevan la reparación ósea. El paso inicial es aislar mediante biop panning el fago que se une al hueso. Proceder a identificar las secuencias peptídicas que se unen a las células mesenquimales, y también determinar los cambios posteriores en la expresión génica.

Realizar experimentos para determinar cómo las secuencias peptídicas pueden ser entregadas al hueso con fines regenerativos. Como paso final, si se examina la reparación ósea histológicamente tomados en conjunto, los resultados pueden ofrecer información importante sobre los mecanismos de diferenciación celular in vitro y reparación ósea in vivo. Las ventajas de utilizar la técnica de barrido de biop con una biblioteca de visualización de fagos son que pudimos identificar péptidos que se dirigen al hueso y se pueden utilizar para estimular la diferenciación de las células mesenquimales y potenciar la reparación ósea.

En última instancia, estas secuencias peptídicas pueden ser útiles en modalidades terapéuticas para la reparación ósea y para el tratamiento de la pérdida ósea como la osteopenia y la osteoporosis. A partir de un estudio en el que ULA y Pascal demostraron que el paneo de biop se puede utilizar para aislar secuencias de péptidos que se dirigen a los vasos sanguíneos, optamos por adaptar este método a los mecanismos de consulta en el hueso. Para el procedimiento de paneo biop in vivo, se perfundieron 10 veces 10 a la 10ª placa que realiza unidades del fago N-E-B-P-H-D 12 fagos muestran la biblioteca de péptidos a través del corazón de un ratón con válvula C de 10 semanas de edad.

Después de aproximadamente cinco minutos, eutanasia al ratón, exponer y diseccionar los fémures, cortar los extremos y extraer la médula ósea. Enjuague el fémur izquierdo tanto por dentro como por fuera con PBS 10 veces. Luego agregue el hueso a las bacterias ER 2 5 3 7.

Para eliminar el fago no unido, use leche descremada en polvo al 2% en una jeringa con una aguja de calibre 21 para enjuagar el canal intermedio del fémur derecho 10 veces. Ahora eluya el fago unido del canal intermedio con tampón de glicina de ácido clorhídrico. pH 2.2 neutralizado con un mo la triss.

Para amplificar el fago, agregue EIT a las bacterias ER 2 5 3 7 y cultive durante 4,5 horas. Transfiera con cuidado los sobrenadantes a tubos nuevos y precipite el fago tres veces mediante la adición de polietilenglicol. Solución de cloruro de sodio, incubar los tubos durante la noche a cuatro grados centígrados.

Finalmente, vuelva a suspender el pellet en TBS con azida de sodio al 0,02%. Coloque el fago en placas para determinar las unidades formadoras de placa de los EIT amplificados. Repita cuatro veces el procedimiento de biopaneo in vivo tanto para el fago eluido como para el no eluido.

Amplificar los fagos agrupados en cultivos bacterianos. Purifique y cuantifique la secuencia de ADN, el ADN final del fago, utilizando el cebador 98 proporcionado con el kit de visualización de fagos. Es importante destacar que calcule la frecuencia de la representación de la secuencia de ADN del fago.

Ahora sintetizar péptidos incorporando una glicina glicina glicina lisina sembrar y amplificar las células D uno. Una línea celular estromal de médula ósea multipotencial clonada de ratón que se desarrolló en nuestro laboratorio al 90% de confluencia. La tripsina es las células y la centrífuga para pelletizar y contar las células de placa de tinción de péptidos en portaobjetos de pocillos de cámara recubierta de gelatina y cultivo durante 24 horas.

Lavar las células con PBS y fijar con 4% de paraldehído durante 30 minutos. Ahora realice incubaciones de bloqueo con glicina seguidas de BSA Aden y BBSA. Soluciones bloqueadoras de biotina.

Añadir 100 micromolares de péptidos biotinilados L siete y R uno. Proceda a lavar las celdas tres veces con PBS durante cinco minutos cada una. Agregue una dilución de uno a 1000 de la cubierta y el papel de aluminio de LOR y cocine en un cajón oscuro durante 30 minutos.

Lave las celdas y monte los deslizamientos de la cubierta con el medio de montaje Vector Shield. Ahora analice los portaobjetos bajo un microscopio fluorescente 24 horas antes de la cirugía. Remoja los cilindros de espuma de gel.

Transfiera los cilindros de espuma de gel con 20 péptidos micromolares L seven o R one o tampón PBS sin péptido a 12 estériles. Cultive bien los platos y refrigere durante la noche a cuatro grados centígrados en el momento de la cirugía. Coloque el compuesto de gel para teléfonos sobre hielo hasta su uso.

Usando una rebaba neumática bajo irrigación salina, cree un gran defecto unicortical oblongo de tres milímetros de ancho por ocho milímetros de largo. Trate el defecto óseo con espumas de gel preparadas insertando todos los andamios implantados con un golpeteo suave. Sacrificar a las ratas y recolectar la tibia en puntos de tiempo definidos, verificar cuidadosamente el defecto óseo y fijar la tibia extraída en formol tamponado neutro al 10% para el corte de parafina.

Por último, tiñe todas las secciones de tejido con eosina de hematina para etiquetar la matriz osteo. El isotiocianato de fluoresceína marcado con Aden permite la detección microscópica de la unión de péptidos en células cultivadas in vitro. Aquí, los péptidos se unen a las células mesenquimales en cultivo para determinar el efecto osteogénico de los péptidos en las células.

Las células mesenquimales in vitro en cultivo pueden tratarse con péptidos de prueba para determinar cambios en la morfología celular. Por ejemplo, en el cuarto día, las células comienzan a agregarse y los agregados se agrandan con el tiempo para formar nódulos. Curiosamente, la sección ósea se tiñó con autofluorescencia h y e bajo luz ultravioleta.

Este mayor contraste entre tejidos óseos y no óseos facilita los análisis para cuantificar la presencia de hueso en las secciones para determinar la reparación ósea en los defectos tratados con gelfoam plus péptido. En comparación con la espuma de gel sola, los defectos que se llenaron con péptido plus mostraron la mayor cantidad de reparación cortical con el tiempo al intentar este procedimiento. Es importante ser extremadamente metódico en la entrada de datos debido a la gran cantidad de especímenes que invariablemente se acumularán con el tiempo hasta que haya seleccionado el grupo final de péptidos.

El desarrollo de la bioplaminación in vivo como técnica para identificar péptidos que se dirigen al hueso significa que ahora tenemos fármacos potenciales que podrían utilizarse como terapia para la reparación ósea y para la pérdida ósea. Uno de los mecanismos que subyace a la reparación ósea también está implicado en la pérdida ósea. Comprender estos mecanismos con más detalle y disponer de herramientas que puedan utilizarse para el tratamiento de trastornos como las fracturas tardías y la osteoporosis ayudará a mejorar las terapias que se pueden idear para la atención sanitaria.