Protocolo para la producción de un cruce genético de los parásitos de la malaria de roedores

El objetivo general de este procedimiento es realizar un cruce genético del parásito de la malaria roedora Plasmodium yoelii con el fin de generar descendencia recombinante. Esto se logra primero inyectando a un grupo de ratones con un inóculo mixto que contiene los dos clones parentales de los parásitos que se van a cruzar. Luego, se utilizan ratones infectados para alimentar mosquitos, dentro de los cuales los gametos de cada cepa parental se fusionarán para formar un cigoto diploide; en esta etapa, la división meiótica puede dar lugar a recombinación genética, produciendo así descendencia recombinante.

Los esporozoítos resultantes se obtienen entonces de las glándulas salivales de los mosquitos y se vuelven a inyectar en ratones receptores ingenuos para obtener parásitos de la fase sanguínea, entre los cuales se encuentran clones recombinantes individuales que pueden aislarse mediante dilución limitada. En un experimento exitoso, entre el 5 y el 10 % de las líneas clonadas serán recombinantes, los cuales pueden caracterizarse mediante genotipificación para marcadores genéticos apropiados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de la malaria, como por ejemplo cuáles son los determinantes genéticos de la resistencia a fármacos y de la transmisibilidad en la malaria.

Parásitos A temperatura ambiente durante dos viales que contienen el estadio sanguíneo congelado, parásitos de malaria que se van a cruzar. En este ejemplo, las dos cepas de parásitos de malaria de roedores utilizadas son plasmodium yoi, oi, y plasmodium. Yoi Nigerians equipar una jeringa con una aguja de calibre 22 a 30 y aspirar 400 microlitros de PBS pH 7.4 utilizando la misma jeringa.

Aspire 100 microlitros de sangre infectada con Thor, invierta la jeringa arriba y abajo hasta que el contenido se mezcle homogéneamente. Durante esta demostración, se utilizarán animales anestesiados para minimizar el dolor y el estrés. La anestesia se realiza inyectando 50 microlitros de una mezcla de fármacos anestésicos que contiene 82,5 miligramos por kilogramo de ketamina y 7,5 miligramos por kilogramo de xilacina en el peritoneo de un ratón.

Supervise a los ratones para controlar la profundidad de la anestesia y prevenir la mortalidad. Con este procedimiento, los ratones permanecerán anestesiados durante 20 a 30 minutos. Antes de la recuperación, inyecte 200 microlitros de solución que contenga parásitos directamente en el peritoneo de un ratón.

Una vez finalizado, deseche la jeringa en un recipiente para objetos punzantes. Mediante este método, infecte dos ratones con cada uno de los dos parásitos que se van a cruzar, entre tres y cinco días después de las inyecciones. Los parásitos en estadio sanguíneo se desarrollarán en los ratones infectados.

Corte la punta de la cola del ratón de los ratones donantes infectados con las diferentes cepas del parásito utilizando tijeras estériles. Recolecte una gota de sangre de la cola del ratón sobre un portaobjetos y realice frotis delgados. Tiña el frotis sanguíneo delgado con tinción de Giemsa.

El colorante Guillem SA no tiñirá los glóbulos rojos no infectados debido a las células no infectadas. La ausencia de un núcleo en SAI tiñirá el núcleo del parásito en los parásitos de glóbulos rojos infectados; los glóbulos rojos aparecen en forma de estadios en anillo, trofozoítos esqui ontes y maites en ruptura. Una vez que la parasitemia alcance entre 1 y 5 % en ambos ratones, los parásitos en estadio sanguíneo pueden recolectarse para la infección con clones mixtos.

Recortar la punta de la cola del ratón de los ratones donantes infectados con los diferentes parásitos. Estrujar con tijeras estériles como se describió anteriormente. Recolectar un microlitro de sangre de la cola del ratón utilizando un capilar de vidrio en un mililitro de PBS estéril; usar 20 microlitros de la suspensión sanguínea para analizar la densidad de glóbulos rojos con cell ome.

Utilizando la densidad de los glóbulos rojos y las mediciones de para, diluya las muestras de sangre en una solución salina citratada fisiológica para obtener una concentración de glóbulos rojos infectados de un millón por 100 microlitros. Combine una muestra de sangre infectada de los dos donantes en una proporción uno a uno para obtener un inóculo de clones mixtos. A continuación, inyecte 100 microlitros de la muestra mixta en el peritoneo de cada ratón que se vaya a infectar.

Utilice dos ratones para infecciones de clon único para permitir la confirmación de la transmisión exitosa de cada cepa parental. Las etapas sexuales del parásito, denominadas gametocitos masculinos y femeninos, deben comenzar a aparecer en la sangre de los ratones alrededor de cuatro días después de la infección en ese momento. Comience a monitorear diariamente a los ratones para detectar la aparición de gametocitos, recolectando sangre de la cola como se describió anteriormente y preparando extensiones delgadas sostenidas de sangre de la cola.

Los citoes masculinos y femeninos son reconocibles debido a la presencia de gránulos grandes o pigmentos. El citoplasma de los citoes gato masculinos es rosa, mientras que el citoplasma de los citoes TER femeninos es azul. Solo los citoes gato maduros presentan una vacuola grande.

Una vez detectados los gametocitos maduros de ambos sexos, los ratones pueden utilizarse para alimentar a los mosquitos. Inyecte 50 microlitros de una solución anestésica de ketamina y xilacina en el peritoneo de cada ratón infectado. Una vez que los ratones estén anestesiados, coloque uno boca abajo sobre la parte superior de una jaula que contenga de 50 a 100 mosquitos hembras Anis defense enzyme que hayan sido privados de fuente de azúcar durante 24 horas y permita que los mosquitos se alimenten durante 30 minutos sin interrupción.

Eutanasiar humanamente a los ratones inmediatamente después del período de alimentación. Si la transmisión es exitosa, nueve días después de la alimentación, los gametocitos ingeridos por los mosquitos se habrán fusionado en cigotos diploides que maduran en oocistos, los cuales pueden observarse en el intestino medio de los insectos. Cuantos más oocistos se detecten, mayores serán las probabilidades de que se hayan generado parásitos recombinantes.

Utilice un aspirador para recolectar de cinco a 10 mosquitos infectados de la jaula y transfiera los mosquitos a un recipiente pequeño. Anestesie los mosquitos utilizando gas de dióxido de carbono y transfiéralos a una placa de Petri de vidrio sobre hielo. Los mosquitos macho cuyas antenas sean notablemente más tupidas que las de las hembras deben descartarse.

Llene dos jeringas con PBS y coloque agujas de calibre 26 de media pulgada. Deposite aproximadamente 100 microlitros de PBS de una jeringa sobre un portaobjetos de vidrio. Transfiera cinco a diez mosquitos hembras anestesiados a la gota de PBS y coloque el portaobjetos sobre un microscopio estereoscópico utilizando las agujas.

Retire las alas y las patas de cada mosquito y luego sostenga el insecto por el tórax y el abdomen posterior. Separe el cuerpo hasta que se libere el intestino medio, una estructura blanca semejante a una bolsa. Separe el intestino medio y deseche el resto del cuerpo mientras realiza las disecciones.

Asegúrese de mantener las mitades del intestino húmedas utilizando el PBS de las agujas de disección. Coloque un cubreobjetos sobre las mitades del intestino una vez finalizado el disección. Examine las mitades del intestino bajo un microscopio óptico a 100 aumentos.

Los OOS serán reconocibles como estructuras circulares de pared gruesa que se encuentran en la superficie externa de los intestinos medios. Cuente el número de OOS en cada intestino medio. Diecisiete días después de la ingesta, los esporozoítos liberados del sys deberían haber migrado hacia las glándulas salivales de los mosquitos, esporozoítos de parásitos de la malaria.

Unas células delgadas con forma de huso para cosechar esporozoítos. Primero, prepare un tubo de recolección utilizando tijeras limpias. Corte la tapa de un pequeño tubo einor de 500 microlitros.

Caliente la punta de una aguja estéril de calibre 19 y perfore la base del tubo. Llene un tercio del tubo con pared de vidrio para crear un filtro. Introduzca el tubo con filtro dentro de un tubo einor más grande de 1,5 mililitros.

Una vez que el aparato de filtración esté listo, recolecte y anestesie los mosquitos como se describió anteriormente. Monte los insectos al aire para la disección como antes, y retire los mosquitos, las cabezas, alas, patas y abdomens. Solo el tórax contiene las glándulas salivales infectadas.

Utilizando pinzas de punta fina, transfiera el tórax a un homogeneizador de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de PBS. Homogenice el tórax en hielo para liberar los esporozoítos de las glándulas salivales y, utilizando una pipeta de vidrio, transfiera los homogenizados al aparato de filtración. Centrifugue el tubo del filtro durante 10 a 20 segundos a 1000 rotaciones por minuto.

Una vez que se hayan centrifugado los homogenatos, recoja el flujo mediante una jeringa equipada con una aguja de calibre 22 a 30. Inyecte de 100 a 500 microlitros de la suspensión de esporozoítos en el peritoneo de un ratón. Comience a monitorear la parasitemia y la densidad de glóbulos rojos en los ratones tres días después de la infección.

Seleccione un ratón que presente una parasitemia del 0,1 al 1 % y cuyos glóbulos rojos infectados contengan principalmente parásitos individuales como donante para el procedimiento de clonación. Extraiga una cantidad adecuada de sangre en PBS, diluya la sangre de la cola del ratón en una solución fría uno a uno de suero de ternera y solución de Ringer para mamíferos para obtener una concentración de 0,6 a un glóbulo rojo infectado por cada 100 microlitros y almacene la inócula en hielo. Limpie el sitio de inyección en la cola con etanol por vía intravenosa.

Inyecte 100 microlitros de sangre infectada diluida en cada uno de hasta 100 ratones. De este modo, cada ratón individual debe recibir un parásito o ninguno. En un experimento exitoso, del 20 al 50 % de los ratones mostrarán un parásito del 0,1 al 0,5 % el día ocho.

Cinco a siete días después, examine a los ratones en busca de la presencia de parásitos en estadio sanguíneo mediante el análisis de frotis finos de sangre sostenidos por gema. A continuación, se puede realizar la genotipificación de los parásitos descendientes del cruce mediante PCR del ADN extraído de muestras de sangre de la cola, utilizando marcadores genéticos en diferentes cromosomas, como microsatélites y polimorfismos de un solo nucleótido. Los parásitos cuyos loci genéticos independientes derivan de los dos clones parentales son clones recombinantes.

La sangre de los animales infectados con parásitos recombinantes puede criopreservarse para uso futuro. En un experimento exitoso, entre el 5 y el 10 % del total de ratones tendrá descendencia recombinante independiente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir procesos genéticos en la malaria.

Parásito más medio yoi. Este método puede ser igualmente aplicable a otras especies de parásitos.