Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas

El objetivo general de este procedimiento es registrar las respuestas evocadas por la luz de las células ganglionares marcadas genéticamente en la retina aislada del ratón. Esto se logra diseccionando primero la retina del ojo del ratón. El segundo paso del procedimiento es tratar la retina con una enzima para eliminar el vítreo restante.

El tercer paso del procedimiento es montar la célula ganglionar de la retina con el lado hacia arriba en la cámara de registro, montar la cámara en la platina del microscopio e identificar las células ganglionares marcadas genéticamente. El paso final del procedimiento es obtener una grabación de toda la célula ganglionar identificada y registrar las respuestas evocadas por la luz. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren las propiedades funcionales de una célula ganglionar definida, tipo en la retina del ratón, y definan las señales que transmite al cerebro a través de registros de pinzas de parche de una sola célula.

Hola, mi nombre es Tiffany Schmidt y soy estudiante de posgrado en neurociencia en el laboratorio del Dr. Paulo Ka Fuji en la Universidad de Minnesota. Esta técnica permite la identificación y el registro de una población de células ganglionares definida y genéticamente marcada y su posterior análisis morfológico. Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el campo visual, como la forma en que los diferentes subtipos de células ganglionares procesan las características clave de los estímulos visuales antes de realizar la cirugía.

Para extraer la retina, la primera tarea es mezclar las ocho soluciones necesarias para el experimento. Los ingredientes de todas las soluciones utilizadas en este experimento se dan en el texto adjunto. Transfiera 200 mililitros de la solución extracelular a un vaso de precipitados de 250 mililitros para el almacenamiento de retina.

Coloque la solución extracelular restante en un embudo separador para la profusión de gravedad durante la grabación. Ambas soluciones deben mantenerse saturadas con un 95% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono en todo momento. Para visualizar las dendritas durante el experimento, agregue un trazador fluorescente como LOR 5 94 a la solución intracelular.

Si planea hacer inmunohistoquímica después del registro de toda la célula, agregue 0.3% de neurobiotina a la solución intracelular. Una vez que se preparan las soluciones necesarias, se sacrifica a un ratón por asfixia con dióxido de carbono, se nuclea el globo ocular insertando suavemente una pinza número dos en ángulo detrás del ojo y levantando el globo ocular. Use tijeras oftalmológicas para limpiar los músculos extraoculares y cortar el nervio óptico.

Coloque el globo ocular en una placa de Petri de 35 milímetros llena de solución extracelular. Corte la córnea con unas tijeras oftalmológicas y extraiga el cristalino con una pinza de número cinco. Use las pinzas número cinco para abrir la esclerótica y cortar el nervio óptico restante donde se unen la retina y la esclerótica.

Separe suavemente la retina de la copa del ojo pasando las pinzas por el espacio entre la retina y la esclerótica. Para ahorrar tiempo, realice cada paso en ambas retinas Antes de pasar al siguiente paso, un paso crucial es eliminar el vítreo adherido a la retina. Comience usando fórceps para agarrar el vítreo transparente por encima de la retina.

Si el vítreo se extrae con éxito, verás una sustancia gelatinosa pequeña y transparente en la punta de las pinzas. Corta cada retina por la mitad para maximizar la cantidad de tejido utilizable y facilitar el montaje de la retina en la cámara de grabación. Coloque las retinas en la solución extracelular oxigenada a temperatura ambiente y minimice la exposición a la luz permitiendo solo una luz ambiental mínima, como la luz de las pantallas de las computadoras, las retinas permanecen viables durante aproximadamente seis horas.

Después de la disección, tome 500 microlitros de la solución extracelular de la solución en la que las retinas adicionales están burbujeando. Diluir en él. Una alícuota de la solución enzimática colagenasa hialuronidasa.

Coloque la solución enzimática en una placa de Petri de 35 milímetros y transfiera una de las retinas disecadas a la Petri. Gire la placa de Petri durante 15 minutos todo el tiempo superfusionando suavemente 95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono en la solución. La solución enzimática elimina cualquier resto de vítreo y permite un acceso más fácil a la capa de células ganglionares Para las retinas de animales más jóvenes con menos vítreo, o si se observan efectos adversos, la digestión se puede acortar a cinco minutos.

Con una pipeta de transferencia de plástico con una punta cortada, retire la retina del medio que contiene la enzima. Lave la retina abundantemente en solución extracelular.

Transfiera la retina a la cámara de grabación. Con la capa de fotorreceptores hacia abajo, absorba cualquier líquido restante con una pipeta o un pañuelo de papel y extienda los lados de la retina para aplanar el tejido. Teniendo cuidado de tocar solo los bordes de la retina y no la capa de células ganglionares.

Para anclar la retina, coloque un anillo de platino con malla de nailon sobre la retina y luego llene inmediatamente la cámara con solución extracelular. Monte la cámara de registro en la platina del microscopio y luego conecte el tubo para la perfusión por gravedad de la solución extracelular, el tubo de succión al vacío y el cable de tierra. Ajusta la gravedad para que gotee a un mililitro por minuto o más rápido.

Si la velocidad de perfusión es demasiado lenta, el tejido no estará suficientemente oxigenado y la señalización sináptica puede verse interrumpida. El siguiente paso es configurar el electrodo para el registro de parches de celda completa. Seleccione una pipeta con una resistencia en el rango de tres a cinco mega ohmios.

Llene la pipeta de registro con una alícuota descongelada de solución intracelular e insértela en el soporte de pipeta mediante iluminación infrarroja y contraste de interferencia diferencial u óptica DIC bajo un objetivo de 10 aumentos. Visualiza la retina y la pipeta de grabación. La luz infrarroja se utiliza para minimizar la exposición de la retina a la luz visible y para minimizar la adaptación a la luz, cambie a un objetivo de 40x y ponga el electrodo a la vista justo por encima del tejido.

La línea de ratón utilizada en este estudio expresa EGFP en sus células ganglionares y, por lo tanto, las células ganglionares son visibles bajo epifluorescencia. La microscopía ilumina la retina con epifluorescencia a 480 nanómetros. Si la retina está sana, las células ganglionares individuales deben ser visibles.

Las retinas enfermas tendrán grandes núcleos granulados y deben desecharse. Seleccione una de las células ganglionares fluorescentes para la grabación y use cinta de laboratorio para marcar la celda seleccionada en el monitor de la computadora. Cambie a la óptica infrarroja para que el cuerpo de la célula ganglionar seleccionado sea visible.

Coloque el electrodo de registro cerca de la célula ganglionar objetivo. Limpie el área que cubre inmediatamente la celda aplicando una suave presión positiva a la grabación. La presión del electrodo se aplica a través de una jeringa de plástico de 12 cc conectada al soporte de pipeta con tubo de polietileno en el amplificador cero.

Cualquier compensación de voltaje. Coloque el electrodo en la célula ganglionar seleccionada hasta que aparezca un hoyuelo en la superficie de la célula. Con el amplificador en modo de pinza de voltaje, aplique un pulso de prueba y controle la corriente que pasa a través de la pipeta.

Aplique presión negativa para crear un sello entre el electrodo y la celda. Libere la presión negativa cuando el sello comience a formarse y espere hasta que la corriente de retención sea indicativa de un sello eléctrico giga entre la membrana de la celda y la pipeta. Aplique pulsos suaves de presión negativa hasta que aparezcan transitorios capacitivos que indiquen que se ha obtenido el modo de grabación de celda completa y, a continuación, libere cualquier aplicación de presión.

Si la resistencia de acceso es superior a 30 mega ohmios, a menudo se puede mejorar mediante pulsos adicionales muy suaves de presión negativa. Después de obtener el modo de celda completa, apague la luz infrarroja y cubra el microscopio con un paño negro. Deje que la celda se oscurezca durante cinco minutos.

Después de cinco minutos, la preparación está lista para la grabación. En el modo de pinza amperimétrica, active la estimulación de luz blanca de campo completo y registre la respuesta de la célula ganglionar. Si la célula ganglionar va a ser estimulada varias veces, se debe permitir que la retina se oscurezca según sea necesario entre las estimulaciones.

El estímulo luminoso también puede modificarse en este punto para incluir estímulos modelados o cromáticos con el fin de evaluar las propiedades de respuesta de las células ganglionares después del registro, el trazador fluorescente en la solución intracelular se habrá difundido a las dendritas al cambiar entre la epifluorescencia y la óptica infrarroja DIC. El trazador se puede visualizar bajo epifluorescencia a 594 nanómetros, y se pueden examinar las dendritas para determinar si la célula ganglionar está activada o estratificada. La neurobiotina que se añadió a la solución intracelular se ha difundido en la célula ganglionar, por lo que el siguiente paso es preparar la retina para la inmunohistoquímica.

Retraiga la pipeta suavemente para minimizar la alteración de la membrana celular. Tenga en cuenta que si registra y rellena solo una célula ganglionar de la retina por preparación, puede establecer correlaciones específicas entre la célula ganglionar registrada y su morfología detallada. A continuación, coloque la retina en la solución de aldehído Paraform y fíjela durante la noche a cuatro grados centígrados después de la fijación durante la noche.

Enjuague la retina fija en PBS haciendo al menos seis cambios de solución de PBS en el transcurso de dos o más horas. Después de enjuagar, transfiera la retina a una placa que contenga solución de bloqueo, coloque la placa en un agitador y déjela reposar durante dos horas. A temperatura ambiente, reemplace la solución de bloqueo con la solución de evidencia de estreptococos y vuelva a colocar la retina en el agitador y déjela incubar durante dos días a cuatro grados centígrados.

Después de dos días, enjuague la retina en PBS haciendo seis enjuagues de 20 minutos cada uno para montar la retina. Colóquelo con el lado de la célula ganglionar hacia arriba en un portaobjetos de vidrio usando un escudo vectorial. Montaje de la cubierta del medio con una cubierta de vidrio, deslizamiento y sellado con esmalte de uñas, la célula ganglionar etiquetada ahora se puede observar bajo un microscopio confocal.

Esta figura muestra las células ganglionares de la retina GFP positivas visualizadas bajo iluminación epifluorescente con un aumento de 40 veces a la izquierda y bajo iluminación DIC a la derecha. Si la retina está sana y la disección fue exitosa, las células ganglionares individuales son visibles bajo DIC a gran aumento. Las retinas enfermas tendrán grandes núcleos granulados y deben desecharse.

Esta figura muestra el tipo de respuesta a la luz que es típica de una célula ganglionar de la retina intrínsecamente fotosensible a la estratificación. Dependiendo del tipo de célula ganglionar de la retina marcada genéticamente en una preparación determinada, las propiedades de respuesta diferirán. Si la respuesta sináptica de una célula ganglionar dada está intacta, entonces la célula debe responder al inicio de la luz o compensada con potenciales de acción.

Y en el caso de una célula ganglionar intrínsecamente fotosensible, una despolarización sostenida, esta figura de una célula ganglionar llena de neurobiotina muestra la morfología de una célula ganglionar de la retina intrínsecamente fotosensible e estratificante M1 fuera de ella. Después del registro de células completas, la inmunohistoquímica permite una correlación de la morfología dendrítica y la respuesta electrofisiológica de las células ganglionares de la retina. Al intentar este procedimiento, es importante recordar oxigenar bien la retina y perfundir el tejido rápidamente para preservar las respuestas sinápticas.

Gracias por ver esta demostración.