Name: Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Aprende a registrar respuestas luminosas en células ganglionares etiquetadas genéticamente en retina aislada de ratón. Este método de electrofisiología permite estudiar la función neuronal en neurociencia.

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Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Damos las gracias a Darwin la horca por su asistencia técnica.

Animal Uso Declaración: Los animales fueron atendidos de conformidad con las directrices descritas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, utilizando los protocolos aprobados por la Universidad de Minnesota Care Animal institucional y el empleo. 1) Preparación de las soluciones <ol><li> Antes de realizar registros electrofisiológicos, las soluciones intracelulares, extracelulares, y la enzima que estar preparados. </li><li> Extracelular solución: mezclar una botella (8,8 g) del medio de polvo de Ames (Sigma) con 1 l de H 2 O y 1,9 g de bicarbonato de sodio (23 mM). En todos los puntos de la solución extracelular está saturado con 95% O 2 / 5% CO 2 mezcla de gases. Transferencia de 200 ml a un vaso de almacenamiento de retina. Ponga la solución queda en el recipiente sistema de perfusión para la perfusión por gravedad una vez la retina se ha montado. </li><li> Solución intracelular: solución intracelular que se han hecho con anterioridad y luego en partes alícuotas 500-1000 alícuotas y almacenado a -20 ° C. Solución intracelular varía en función de la experiencia necesaria, para las grabaciones de pinza de corriente se muestra aquí usamos (en mm): 125 K-gluconato, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0,5 mM NaGTP pH a 7,2 con KOH 5. Un marcador fluorescente como 10 M-594 AlexaFluor hidrazida (Invitrogen) se pueden agregar a visualizar las dendritas durante el experimento, y neurobiotin (0,3%) también pueden ser incluidos para el análisis de la anatomía de la célula después de su registro. Cuando esté listo para grabar, descongelar solución intracelular. </li><li> Solución de la enzima: Combine 10.000 unidades de colagenasa (Worthington productos químicos) con 83 mg hialuronidasa (productos químicos Worthington) en 4.150 ml de la solución extracelular. Almacenar en alícuotas de 50 l a -20 ° C. Alícuotas se puede utilizar por varias semanas. Cuando esté listo para el tratamiento de la retina, se diluye en 500 l alícuota de la solución de burbujas extracelular. </li><li> Solución tampón de fosfato (PBS): en 800 ml de H 2 O añaden 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,4 g de Na 2 HPO 4 y 0,24 g de KH 2 PO 4. Llevar el pH a 7,4 con NaOH. Ajustar el volumen de 1 L. </li><li> Tampón fosfato 0,2 M: En 800 ml de H 2 O añadir 21,8 g de Na 2 HPO 4 y 6,4 g de NaH 2 PO 4. Alcanzar un volumen de 1 L. </li><li> Paraformaldehído al 4% Solución: Heat 50 ml H 2 O a 60 ° C. Añadir 4 g de paraformaldehído, se agita durante varios minutos. Añadir unas gotas de NaOH 1M (alrededor de 5 gotas), seguir revolviendo hasta que la solución es clara. Añadir 50 ml de tampón fosfato 0,2 M en el vaso. Verifique el pH con tiras de pH (~ 7,4). Filtrar y enfriar. </li><li> Solución de bloqueo (10% suero de cabra, un 0,5% TritonX100): En 1,8 ml de PBS añadir 0,2 ml de suero de cabra y 10 l de Triton X-100. TritonX-100 sirve para permeabilizar el tejido. </li><li> Estreptavidina solución (5% suero de cabra, un 0,5% TritonX100, 1:500 estreptavidina 594): En 1,9 ml de PBS, añadir 0,1 ml de suero de cabra, 10 l de Triton X-100 y 4 L de estreptavidina 594. </li></ol> 2) El aislamiento de la retina de ratón Herramientas de disección es necesario: 1 # 2 pinzas, 2 º 5 pinzas, tijeras oftalmológicas <ol><li> Eutanasia ratón de acuerdo a los protocolos aprobados, en este caso asfixia de CO 2 y el globo ocular enucleación, insertando suavemente un ángulo # 2 pinzas detrás del ojo y levantando el globo ocular. </li><li> Lugar del globo ocular en un 35 mm placa de Petri con solución extracelular. Cortar el nervio óptico y los músculos extraoculares adjunto o del tejido conectivo con unas tijeras oftalmológicas. Cortar la córnea con una tijera de oftalmología y tire de la lente usando # 5 fórceps. Romper la esclerótica con un par de pinzas # 5 y el uso de las pinzas para cortar el nervio óptico en la retina y la esclerótica se encuentran en el disco óptico. Con cuidado, vaya de la retina se desprenda de la ojera. Sugerencia: cada paso en ambas retinas antes de pasar al siguiente paso para minimizar el tiempo. </li><li> El uso de fórceps para extraer humor vítreo adherido a la retina. Esto puede ser realizado por "agarrar" el humor vítreo transparente por encima de la retina con una pinza. El humor vítreo, si elimina correctamente, debe ser visible como una sustancia transparente y gelatinosa en las pinzas. Sugerencia: Cortar la retina en la mitad tras la retirada del vítreo maximizará la cantidad de tejido útil y hacer el montaje en la cámara sea más fácil. </li><li> Mantener la retina en la solución extracelular oxigenada a temperatura ambiente en un ambiente oscuro con la luz ambiental mínimo hasta que estén listos para ser digeridos. Retinas se pueden almacenar en esta forma de a 6 horas. </li></ol> 3) Tratamiento de la retina con la mezcla de enzimas y de montaje en la cámara de grabación <ol><li> Diluir una alícuota de la colagenasa / hialuronidasa en 500 l solución extracelular, la solución en lugar de 35 mm placa de Petri y la transferencia de la retina. </li><li> Mantener la retina contienenING placa de Petri, cubiertas y en la oscuridad, en un 95% O2 / 5% CO 2 ambiente durante 15 minutos con agitación suave. Este paso ayuda a digerir cualquier vítreo restante y permite un acceso más fácil a la capa de células ganglionares. Sugerencia: para las retinas de los animales más jóvenes con menos humor vítreo o si se observan efectos adversos, el tiempo se puede acortar a ~ 5 minutos. </li><li> Retire la retina de enzimas que contienen medio y lavar ampliamente en la solución extracelular </li><li> La transferencia de la retina en la grabación de la cámara 6 con la capa de fotorreceptores hacia abajo. Evacuación de la resto de fluido, ya sea con una pipeta o el tejido y el despliegue lados de la retina para aplanar el tejido con cuidado de tocar sólo los bordes de la retina, en particular, evitando el contacto con la capa de células ganglionares. Colocar un anillo de platino con una malla de nylon en la retina para anclar el tejido e inmediatamente llenar la cámara con una solución extracelular. </li><li> Monte la cámara de grabación en la platina del microscopio, meter un tubo de perfusión por gravedad y succión al vacío y conectar el cable de tierra. </li></ol> 4) La localización de las células ganglionares de la EGFP expresión y la estimulación de luz <ol><li> Perfusión de la retina por la gravedad con solución extracelular en las tasas de 1 mL / min o más rápido. Consejo: Si la tasa de perfusión es demasiado lento, el tejido no será lo suficientemente oxigenada y la señalización sináptica puede ser interrumpido. </li><li> Llenar una pipeta de grabación con la solución intracelular y la inserta en el soporte de la pipeta. Sugerencia: Las pipetas con resistencias en el rango de 3 a 5MΩ dar los mejores resultados. </li><li> Visualizar la retina bajo infrarrojos contraste de interferencia diferencial (DIC) óptica a bajo aumento (objetivo de 10X, NA 0,3) para localizar la pipeta de grabación. La luz infrarroja se utiliza para minimizar la exposición de la retina a la luz visible y minimizar la adaptación a la luz. Mover a un mayor aumento (objetivo de 40X, NA 0.8) y llevar el electrodo en vista justo por encima de los tejidos. </li><li> A mayor aumento (objetivo 40X), iluminar la retina con epifluorescencia (480 nm para EGFP) y seleccione una de las células ganglionares fluorescente y marca de monitor de ordenador con cinta (fig. 1A). </li><li> Bajo iluminación DIC y de infrarrojos, la posición del electrodo de registro cerca de las células ganglionares específicas (Figura 1). Limpie el área que cubre inmediatamente la célula mediante la aplicación de presión positiva suave para electrodo de registro a través de una jeringa de plástico de 12cc conectada a la titular de la pipeta con tubería de polietileno. En el amplificador, las compensaciones a cero de tensión. Electrodo en lugar de las células ganglionares seleccionado hasta que aparece un hoyuelo en la superficie celular. </li><li> Con el amplificador en el modo de fijación de voltaje, aplicar un pulso de prueba y controlar la corriente que pasa a través de la pipeta. Aplicar presión negativa para crear el sello entre el electrodo y celular. De liberación de presión negativa cuando la célula empieza a sellar y esperar a que la celebración actual es indicativo de un sello GΩ eléctrico entre la membrana celular y la pipeta. Aplicar suaves pulsos de presión negativa hasta que aparecen los transitorios capacitivos y luego suelte cualquier aplicación de presión. Consejo: si el acceso (la serie) la resistencia es alta (&gt; 30MΩ), esto a menudo puede ser mejorado por otros, muy suave, los pulsos de presión negativa. </li><li> Una vez que un sello estable se ha llegado a aplicar un pulso de presión negativa. Después del modo de célula completa se obtiene, permitirá la célula para adaptarse oscuridad durante 5 minutos. Registro, en el modo de corriente con la pinza, la respuesta a campo completo, la estimulación de luz blanca (fig. 1B). </li><li> Después de su registro, AlexaFluor-594 se han difundido a las dendritas. El marcador puede ser visualizado en epifluorescencia a 594 nm y se utiliza para determinar si una célula ganglionar es-On, Off-o bi-estratificado por cambiar de óptica infrarroja epifluorescencia y DIC 5. </li><li> Si neurobiotin está incluido en la pipeta y la retina va a ser procesadas para inmunohistoquímica, entonces pipeta suavemente retraído para proporcionar una mínima interrupción de la membrana. </li></ol> 5) Análisis de la anatomía de las células ganglionares registrado Llenado con neurobiotin permite un análisis más detallado morfológicas de las células ganglionares después de su registro. Consejo: Si las correlaciones específicas entre las células ganglionares registrado y la morfología detallada que se desea, puede ser mejor para grabar y completar una sola RGC por la preparación. <ol><li> Si neurobiotin fue incluido en la solución intracelular luego colocar la retina en la solución de paraformaldehído y fijar la noche a 4 ° C. </li><li> Enjuague en PBS, por lo menos 2 horas, por lo menos 6 cambios. La transferencia de la retina a una placa que contiene la solución de bloqueo. Deja en solución de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente en la coctelera. </li><li> Reemplace la solución de bloqueo con la solución de estreptavidina. Incubar 2 días a 4 ° C en el agitador. Enjuague la retina en PBS, 6 enjuagues, 20 min cada uno. </li><li> Monte la retina con Vectashield en un portaobjetos de vidrio.La retina se debe colocar con las células ganglionares de arriba. Realizar microscopia confocal (fig. 1C). </li></ol> Resultados representante Si la retina está sana y la disección se ha realizado correctamente, las células ganglionares de la persona deben ser visibles en la CID a gran aumento (fig. 1A). Retinas no saludables se tienen grandes núcleos, granulado y debe ser desechado. Si la respuesta sináptica de las células ganglionares dado está intacta, la célula debe responder al inicio de la luz o el desplazamiento de los potenciales de acción y, en el caso de una de las células ganglionares intrínsecamente fotosensibles-(fig. 1B), una despolarización sostenida. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Localización, registro y tinción de las células ganglionares de la retina marcados con fluorescencia. (A) RGC GFP positivos visualizado bajo iluminación epifluorescencia con un aumento de 40X (izquierda) y con iluminación DIC (panel derecho). (B) respuesta a la luz de una Synaptic células ganglionares de la retina intrínsecamente fotosensibles M2 registró en su conjunto de células modo de pinza de corriente de la CGR, marcados con fluorescencia. (C) M1 células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles que se identificó bajo epifluorescencia, blanco de células enteras de grabación, llenos de neurobiotin, y luego procesadas para inmunohistoquímica.

<ol><li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
<li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li>
<li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li>
<li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+address+book+for+retinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li>
<li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li>
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<li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li>
</ol>

Esta técnica es aplicable a todas las grabaciones de células ganglionares de la retina de una retina aislada. Aunque en la línea de ratón utilizado anteriormente intrínsecamente fotosensibles, melanopsina expresar CGR se etiquetan con EGFP 2, 5, este protocolo es fácilmente transferible a otras líneas de marcado con fluorescencia RGC o puede ser generalizada para grabar desde CGR seleccionados al azar también. Esta técnica es particularmente útil debido a que el cenador dendríticas de cada CGR y sus respectiv...

<table><tbody><tr><td>Medio de Ames&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS005273</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazyde AlexaFluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A10442</td><td></td></tr><tr><td>Neurobiotina</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP1120</td><td></td></tr><tr><td>Electrodos</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras oftalmológicas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina 594</td><td>Invitrogen</td><td>S32356</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td></td></tr></tbody></table>

una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Los primeros pasos en la visión de los vertebrados tienen lugar cuando la luz estimula los fotorreceptores de los bastones y conos de la retina 1. Esta información es luego separada en lo que se conoce como las vías de ON y OFF. La información fotorreceptores señal de luz a las células bipolares (BC), que despolarizan en respuesta a los aumentos (en BC) o disminuye (Off BCS) en la intensidad de luz. Esta separación de la luz información se mantiene en el nivel de las células ganglionares de la retina (CGR), que tienen dendritas estratificación, ya sea en el sublamina fuera de la capa plexiforme interna (IPL), donde reciben la entrada de excitación directa de Off chalecos, o la estratificación en En el sublamina de la IPL, donde reciben la entrada de excitación directa de El BCS. Esta segregación de información acerca de los aumentos o disminuciones en la iluminación (el encendido y apagado vías) se conserva y señaló que el cerebro de forma paralela. La CGR son las celdas de salida de la retina, y por lo tanto una importante célula de estudio con el fin de entender cómo la luz información es transmitida al núcleo visual en el cerebro. Los avances en la genética del ratón en las últimas décadas han dado lugar a una variedad de líneas fluorescentes reportero del ratón en poblaciones específicas de RGC están etiquetados con una proteína fluorescente para permitir la identificación de los subtipos de RGC 2 3 4 y orientación específica para el registro electrofisiológico. A continuación, presentamos un método para registrar las respuestas de la luz de las células ganglionares de la etiqueta fluorescente en una preparación intacta, la retina aislada. Esta preparación la retina aislada permite grabaciones de CGR en la glorieta dendríticas está intacto y las entradas a través de la glorieta dendríticas RGC todo se conservan. Este método es aplicable en una amplia variedad de subtipos de células ganglionares y se presta a una amplia variedad de una sola célula técnicas fisiológicas.

Este artículo proporciona una descripción de cómo analizar y record de la preparación aislada de la retina en el ratón. En particular, se describe la forma de registrar las respuestas de la luz de una población de células ganglionares marcados con fluorescencia y, posteriormente, identificar y analizar su morfología.

Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas

Los primeros pasos de la visión en los vertebrados ocurren cuando la luz estimula los fotorreceptores convexity (bastones) y conos de la retina 1. Esta información es entonces...

El objetivo general de este procedimiento es registrar respuestas evocadas por la luz en células ganglionares etiquetadas genéticamente en la retina aislada del ratón. Esto se logra primero mediante la disección de la retina del ojo del ratón. El segundo paso del procedimiento consiste en tratar la retina con enzima para eliminar el vítreo restante.El tercer paso del procedimiento consiste en montar la retina con la capa de células ganglionares hacia arriba en la cámara de registro, colocar la cámara sobre la platina del microscopio e identificar las células ganglionares marcadas genéticamente. El paso final del procedimiento es obtener un registro de célula entera de la célula ganglionar identificada y registrar las respuestas evocadas por la luz. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren las propiedades funcionales de un tipo definido de célula ganglionar en la retina del ratón, y definir las señales que esta transmite al cerebro mediante registros individuales con microelectrodos de parche.Hola, mi nombre es Tiffany Schmidt y soy estudiante de posgrado en neurociencia en el laboratorio del Dr. Paulo Ka Fuji en la Universidad de Minnesota. Esta técnica permit

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Investigación

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Neurociencia

Aquí se describe un procedimiento para la generación adaptada a la oscuridad rebanadas de la retina del ratón de los registros electrofisiológicos.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Se describe un método relativamente simple de transretinal electrorretinograma (ERG) para la obtención de grabaciones photoresponses conos y bastones de la retina del ratón intacto. Este enfoque se aprovecha del bloque de la transmisión sináptica de fotorreceptores para aislar sus respuestas de luz y grabar usando electrodos colocados sobre el terreno a través de la aislada plana montada en la retina.

Transretinal Grabaciones ERG de retina del ratón: Rod y el Cono Photoresponses

Este artículo describe la grabación de las células individuales de marcado con fluorescencia poblaciones neuronales en la retina del ratón intacto. Mediante el uso de excitación de dos fotones infrarrojos células transgenetically etiquetado fueron objeto de grabación de patch-clamp para estudiar la luz de sus respuestas, las propiedades de campo receptivo, y la morfología.

Caracterización electrofisiológica de las buenas prácticas agrarias que expresan las poblaciones de células en la retina intacta

Fuente: Laboissonniere, et. al. Secuenciación de ARN unicelular de subconjuntos definidos de células ganglionares de la retina. J. Vis. Exp. (2017).  Este video muestra una técnica de trazado fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares de la retina (RGC) en la retina de un ratón transgénico. El proceso consiste en asegurar la retina aislada en una cámara de registro, mantener la viabilidad celular con perfusión oxigenada y dirigirse a las RGC marcadas con fluorescencia...

Identificación de subtipos de células ganglionares de la retina de ratón mediante trazado fluorescente

Se describe la preparación de rodajas finas de la retina acuáticos salamandras tigre...

Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

Este artículo de vídeo ilustra los set-up, los procedimientos para remendar los cuerpos celulares y cómo implementar clamp grabaciones dinámicas de las células ganglionares de todo el montaje del ratón retinas. Esta técnica permite la investigación de la contribución precisa de entradas sinápticas excitatorias e inhibitorias, y su magnitud relativa y el momento para spiking neuronal.

Implementar Clamp dinámico con conductancias sinápticas y artificiales en células de ratón ganglionares retinianas

Demostraremos cómo preparar cortes de retina a partir del ojo del ratón y registrar las respuestas a la luz en las neuronas de la retina. Todo el procedimiento se lleva a cabo en condiciones adaptadas a la oscuridad.

Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

Este protocolo muestra cómo realizar la grabación de células enteras patch clamp en neuronas de la retina de una preparación plana de montaje.

Patch Clamp grabación de células amacrinas Starburst en un plano de montaje Preparación de Deafferentated retina del ratón

Aquí, presentamos un enfoque combinatorio para clasificar los tipos de células neuronales antes del aislamiento y para la posterior caracterización de los transcriptomas de una sola célula. Este protocolo optimiza la preparación de muestras para el éxito de secuenciación de ARN (RNA-Seq) y describe una metodología diseñada específicamente para la mejora de la comprensión de la diversidad celular.

RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

Millones de personas sufren de enfermedades degenerativas retinianas que resultan en ceguera irreversible. Un elemento común de muchas de estas enfermedades es la pérdida de células ganglionares de la retina (RGCs). Este protocolo detallado describe el aislamiento de los RGC murinos primarios mediante selección positiva y negativa con citometría de flujo.

Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo

Este trabajo presenta una preparación alternativa de retina de montaje plano en la que la eliminación de los cuerpos de las células fotorreceptoras permite una difusión más rápida de los anticuerpos y un mejor acceso de la pipeta de parche a las neuronas internas de la retina para experimentos de inmunohistoquímica, hibridación in situ y electrofisiología.

Retina dividida como una preparación mejorada de montaje plano para estudiar las neuronas de la capa nuclear interna en la retina de vertebrados

Aprende a registrar respuestas luminosas en células ganglionares etiquetadas genéticamente en retina aislada de ratón. Este método de electrofisiología permite estudiar la función neuronal en neurociencia.

Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas (Video) | JoVE Journal

Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas

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