Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas

El objetivo general de este procedimiento es registrar respuestas evocadas por la luz en células ganglionares etiquetadas genéticamente en la retina aislada del ratón. Esto se logra primero mediante la disección de la retina del ojo del ratón. El segundo paso del procedimiento consiste en tratar la retina con enzima para eliminar el vítreo restante.

El tercer paso del procedimiento consiste en montar la retina con la capa de células ganglionares hacia arriba en la cámara de registro, colocar la cámara sobre la platina del microscopio e identificar las células ganglionares marcadas genéticamente. El paso final del procedimiento es obtener un registro de célula entera de la célula ganglionar identificada y registrar las respuestas evocadas por la luz. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren las propiedades funcionales de un tipo definido de célula ganglionar en la retina del ratón, y definir las señales que esta transmite al cerebro mediante registros individuales con microelectrodos de parche.

Hola, mi nombre es Tiffany Schmidt y soy estudiante de posgrado en neurociencia en el laboratorio del Dr. Paulo Ka Fuji en la Universidad de Minnesota. Esta técnica permite la identificación y el registro de una población definida de células ganglionares marcadas genéticamente y el posterior análisis morfológico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la visión, como la forma en que distintos subtipos de células ganglionares procesan características importantes de los estímulos visuales antes de realizar la cirugía.

Para extraer la retina, la primera tarea consiste en preparar las ocho soluciones necesarias para el experimento. Los componentes de todas las soluciones utilizadas en este experimento se indican en el texto adjunto. Transfiera 200 mililitros de la solución extracelular a un vaso de precipitados de 250 mililitros para el almacenamiento de la retina.

Coloque la solución extracelular restante en un embudo de separación para la perfusión por gravedad durante la grabación. Ambas soluciones deben mantenerse saturadas en todo momento con 95%oxígeno, 5%dióxido de carbono. Para visualizar las dendritas durante el experimento, agregue un trazador fluorescente como LOR 5 94 a la solución intracelular.

Si planea realizar inmunohistoquímica después del registro de célula completa, agregue 0,3 % de neurobiotina a la solución intracelular. Una vez preparadas las soluciones necesarias, sacrifique un ratón mediante asfixia con dióxido de carbono, enuclee el globo ocular insertando suavemente unas pinzas anguladas número dos detrás del ojo y levantando el globo ocular. Utilice tijeras oftálmicas para eliminar los músculos extraoculares y cortar el nervio óptico.

Coloque el globo ocular en una placa de Petri de 35 milímetros llena con solución extracelular. Corte la córnea con tijeras oftalmológicas y extraiga el cristalino utilizando una pinza número cinco. Use la pinza número cinco para abrir la esclerótica y seccionar el nervio óptico restante en el punto donde la retina y la esclerótica se encuentran.

Retire suavemente la retina del copa ocular pasando la pinza por el espacio entre la retina y la esclerótica. Para ahorrar tiempo, realice cada paso en ambas retinas antes de pasar al siguiente paso; un paso crucial es eliminar el vítreo adherido a la retina. Comience utilizando la pinza para agarrar el vítreo transparente situado por encima de la retina.

Si el vítreo se elimina con éxito, se observará una pequeña sustancia gelatinosa y transparente en la punta de la pinza. Corte cada retina por la mitad para maximizar la cantidad de tejido utilizable y facilitar su montaje en la cámara de registro. Coloque las retinas en la solución extracelular oxigenada a temperatura ambiente y minimice la exposición a la luz permitiendo únicamente una iluminación ambiental mínima, como la procedente de las pantallas de computadora; bajo estas condiciones, las retinas permanecen viables durante aproximadamente seis horas.

Tras la disección, tome 500 microlitros de la solución extracelular de la solución en la que burbujean los ojos extra. Diluya en ella una alícuota de la solución enzimática de colagenasa-hialuronidasa.

Coloque la solución enzimática en una placa de Petri de 35 milímetros y transfiera una de las retinas diseccionadas a la placa. Gire la placa de Petri durante 15 minutos, superponiendo suavemente todo el tiempo una mezcla de 95% oxígeno y 5% dióxido de carbono en la solución. La solución enzimática elimina cualquier resto de vítreo y facilita el acceso a la capa de células ganglionares. Para retinas de animales más jóvenes con menos vítreo, o si se observan efectos adversos, la digestión puede acortarse a cinco minutos.

Utilizando una pipeta de transferencia de plástico con la punta cortada, retire la retina del medio que contiene la enzima. Lave la retina extensamente con solución extracelular.

Transfiera la retina a la cámara de registro. Con la capa de fotorreceptores orientada hacia abajo, retire cualquier líquido residual con una pipeta o con un tejido, y enrolle los bordes de la retina para aplanar el tejido. Tenga cuidado de tocar únicamente los bordes de la retina y no la capa de células ganglionares.

Para fijar la retina, coloque un anillo de platino con malla de nailon sobre la retina y luego llene inmediatamente la cámara con solución extracelular. Monte la cámara de registro sobre la platina del microscopio y luego conecte el tubo para la perfusión por gravedad de la solución extracelular, el tubo de succión al vacío y el cable de tierra. Ajuste la gravedad de modo que gotee a un mililitro por minuto o más rápido.

Si la velocidad de perfusión es demasiado lenta, el tejido no se oxigenará suficientemente y la señalización sináptica podría alterarse. El siguiente paso consiste en preparar el electrodo para el registro de parche en célula íntegra. Seleccione una pipeta con una resistencia en el rango de tres a cinco megaohmios.

Llene la pipeta de registro con una alícuota descongelada de solución intracelular e insértela en el porta-pipetas utilizando iluminación infrarroja y óptica de contraste de interferencia diferencial o DIC bajo un objetivo de 10x. Visualice la retina y la pipeta de registro. La luz infrarroja se utiliza para minimizar la exposición de la retina a la luz visible y para reducir la adaptación a la luz; cambie a un objetivo de 40x y acerque el electrodo a la vista justo por encima del tejido.

La línea de ratón utilizada en este estudio expresa EGFP en sus células ganglionares, por lo que las células ganglionares son visibles mediante fluorescencia epiluminiscente. La microscopía ilumina la retina con fluorescencia epiluminiscente a 480 nanómetros. Si la retina está sana, deberían observarse las células ganglionares individuales.

Las retinas no saludables tendrán núcleos grandes y granulares y deben descartarse. Seleccione una de las células ganglionares fluorescentes para el registro y use cinta adhesiva de laboratorio para marcar la célula seleccionada en la pantalla del ordenador. Cambie a óptica infrarroja para que el cuerpo celular de la célula ganglionar seleccionada sea visible.

Coloque el electrodo de registro cerca de la célula ganglionar objetivo. Limpie el área que cubre inmediatamente la célula aplicando una presión positiva suave al registro. La presión en el electrodo se aplica mediante una jeringa plástica de 12 cc conectada al porta-pipetas con un tubo de polietileno en el cero del amplificador.

Cualquier desviación de voltaje. Coloque el electrodo sobre la célula ganglionar seleccionada hasta que aparezca una depresión en la superficie celular. Con el amplificador en modo de fijación de voltaje, aplique un pulso de prueba y supervise la corriente que pasa a través de la pipeta.

Aplique presión negativa para crear un sello entre el electrodo y la célula. Libere la presión negativa cuando comience a formarse el sello y espere hasta que la corriente de mantenimiento indique un sello eléctrico de gigaohmios entre la membrana celular y la pipeta. Aplique pulsos suaves de presión negativa hasta que aparezcan transitorios capacitivos, lo que indica que se ha alcanzado el modo de registro de célula completa, y luego libere cualquier aplicación de presión.

Si la resistencia de acceso es mayor de 30 megaohmios, esto a menudo puede mejorarse mediante pulsos adicionales muy suaves de presión negativa. Una vez obtenido el modo de célula íntegra, apague la luz infrarroja y cubra el microscopio con un paño negro. Deje que la célula se adapte a la oscuridad durante cinco minutos.

Después de cinco minutos, la preparación está lista para la grabación. En el modo de fijación de corriente, active la estimulación luminosa blanca de campo completo y registre la respuesta de la célula ganglionar. Si se va a estimular la célula ganglionar varias veces, se debe permitir que la retina se adapte a la oscuridad según sea necesario entre estimulaciones.

El estímulo luminoso también puede modificarse en este punto para incluir estímulos con patrón o cromáticos con el fin de evaluar las propiedades de respuesta de las células ganglionares tras el registro; la traza fluorescente en la solución intracelular se habrá difundido hacia las dendritas alternando entre fluorescencia epiluminiscente y óptica infrarroja DIC. La traza puede visualizarse mediante fluorescencia epiluminiscente a 594 nanómetros, y se pueden examinar las dendritas para determinar si la célula ganglionar es del tipo on-off o estratificada. La neurobiotina que se añadió a la solución intracelular ha difundido hacia la célula ganglionar, por lo que el siguiente paso consiste en preparar la retina para la inmunohistoquímica.

Retraiga suavemente la pipeta para minimizar la perturbación de la membrana celular. Tenga en cuenta que si registra y llena solo una célula ganglionar retiniana por preparación, entonces podrá realizar correlaciones específicas entre la célula ganglionar registrada y su morfología detallada. A continuación, coloque la retina en la solución de paraformaldehído y fíjela durante la noche a cuatro grados Celsius tras la fijación durante la noche.

Lave la retina fijada en PBS realizando al menos seis cambios de solución de PBS durante un período de dos horas o más. Después del lavado, transfiera la retina a una placa que contenga solución bloqueadora, coloque la placa en un agitador y déjela reposar durante dos horas. A temperatura ambiente, reemplace la solución bloqueadora con la solución strep evidence y vuelva a colocar la retina en el agitador; incube durante dos días a cuatro grados Celsius.

Después de dos días, enjuague la retina en PBS realizando seis enjuagues de 20 minutos cada uno para montarla. Colóquela con el lado de las células ganglionares hacia arriba sobre un portaobjetos utilizando vector shield. Cubra con un medio de montaje, coloque un cubreobjetos y selle con esmalte de uñas; ahora se puede observar la célula ganglionar marcada bajo un microscopio confocal.

Esta figura muestra células ganglionares de la retina positivas para GFP visualizadas mediante iluminación fluorescente epi a 40 aumentos a la izquierda y mediante iluminación DIC a la derecha. Si la retina está sana y la disección fue exitosa, las células ganglionares individuales son visibles mediante DIC a alto aumento. Las retinas no sanas tendrán núcleos grandes y granulares y deben descartarse.

Esta figura muestra el tipo de respuesta a la luz que es típica de una célula ganglionar retiniana fotosensible intrínseca M dos estratificada. Dependiendo del tipo de célula ganglionar retiniana marcada genéticamente en una preparación determinada, las propiedades de la respuesta variarán. Si la respuesta sináptica de una célula ganglionar determinada está intacta, entonces la célula debe responder al inicio o al cese de la luz con potenciales de acción.

Y en el caso de una célula ganglionar intrínsecamente fotosensible, una despolarización sostenida; esta figura de una célula ganglionar rellena con neurobiotina muestra la morfología de una célula ganglionar retiniana intrínsecamente fotosensible típica del tipo M1 con estratificación en la capa OFF. Tras el registro en configuración de célula íntegra, la inmunohistoquímica permite establecer una correlación entre la morfología dendrítica y la respuesta electrofisiológica de la célula ganglionar retiniana. Al intentar este procedimiento, es importante recordar oxigenar adecuadamente el compartimento retiniano y perfundir rápidamente el tejido para preservar las respuestas sinápticas.

Gracias por ver esta demostración.