Name: La criopreservación de tejido cortical Bloques para la generación de cultivos neuronales altamente enriquecido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprende a criopreservar bloques de tejido cortical para generar cultivos neuronales enriquecidos. Este protocolo utiliza DMSO al 10% y nitrógeno líquido para mantener la viabilidad celular a largo plazo.

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Esta investigación fue financiada por becas de la Investigación de Pregrado Programa de Oportunidades de la UCI (AR y SP) y las subvenciones del Estado de California Iniciativa de Enfermedades de Alzheimer y los Institutos Nacionales de Salud de subvención no. HD38466, y el Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer no se conceda ninguna. AG16573 (JB)

1. La criopreservación de tejido cortical bloques Preparación de materiales <ol><li> Preparar buffer 1X Hank solución de sal (HBSS) diluyendo en solución madre 10 veces en agua estéril (1:9). HBSS almacenar a 4 ° C. </li><li> Prepare un 10% medio de congelación DMSO mediante la dilución de DMSO en HBSS (1:9). El medio de congelación debe ser fresca antes de la crioconservación y se almacenan a 4 ° C hasta que se enfríe. </li><li> Una hoja de afeitar de acero se utiliza para la tala sistemática de los tejidos. Antes de su uso, la hoja de afeitar se esteriliza por inmersión en etanol al 70% durante 2 horas. Inmediatamente antes de la elaboración del tejido, enjuagar la cuchilla con agua estéril tres veces. Evite dejar la navaja en agua estéril para una cantidad excesiva de tiempo, ya que es propensa a la oxidación. </li><li> Un contenedor de congelación Nalgene se carga con crioviales (2,5 ml) y luego llevados a un gabinete biológicos estériles. 1 ml de medio de congelación frío se añade a cada vial. El contenedor de congelación se coloca a 4 ° C durante al menos 2 horas. </li></ol> Limpieza, picado, congelación y <ol><li> El tejido cerebral para ser congelados se limpia de la membrana de las meninges y los vasos sanguíneos. Use puntas aguja estéril para retirar cuidadosamente los restos de los tejidos mientras se trabaja en la parte superior de una bolsa de hielo. Tejido limpiados deben ser enjuagados con un poco de HBSS frío y trasladado a una nueva placa de Petri para picar. </li><li> Trabajo en la parte superior de una bolsa de hielo, use una hoja de afeitar esterilizada para cortar rápidamente los tejidos en aproximadamente 1 mm a 3 cuadras. Trabajar con pequeñas porciones de tejido limpiado en un tiempo resulta en un mejor control sobre el procedimiento de cortar, lo que resulta en tamaños de bloque más uniforme. </li><li> Agregue lentamente el tejido cortado en 50 ml de HBSS en un tubo cónico de 50 ml. Enjuague suavemente la placa de Petri con HBSS para recoger los bloques de tejido restante. Permita que los bloques de tejido para descender al fondo del tubo, la creación de un tejido muy apretadas bloque de pellets. </li><li> Mientras que el tejido es la solución, poner el contenedor de congelación previamente enfriada y crioviales en la cabina de seguridad biológica. Destapa todos los crioviales para acelerar el proceso de adición de tejido. </li><li> Después de todos los bloques de tejido se han asentado, Aspire con cuidado el exceso de HBSS, dejando una capa muy fina de los medios de comunicación por encima de la pastilla. Centrifugación se recomienda, ya que hará que los bloques de tejido se adhieran unas a otras, disminuyendo significativamente la eficiencia de la congelación. </li><li> Poco a poco recolectar 200 l de la parte inferior del bloque de pellets sueltos tejido mediante el uso de punta de la pipeta con orificios de ancho (corte la punta con unas tijeras estériles). Transferir el material a un criovial y pasar a los tejidos próximos, de nuevo, recogiendo la parte inferior de la pastilla. Es esencial que el procedimiento de asignación de todo el tejido no toma más de 3-4 minutos por cada contenedor de congelación. Esto asegura que el tejido se expone a DMSO por sólo un corto período de tiempo antes de la congelación. Después de transferir el tejido de los viales, coloque el recipiente de congelación en un congelador de-80oC durante al menos 4 horas. Por otra parte, el contenedor de congelación se puede dejar toda la noche a -80 oC. Repita este proceso para todos los contenedores de congelación restantes. </li><li> Transferir el crioviales desde el contenedor de congelación (s) a una Caja criogénica y el lugar en un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 2. Descongelación y cultivo de bloques congelados de tejido cortical Preparación de materiales <ol><li> Un día antes de descongelar las muestras de tejido, poli-L-lisina recubierto Petri / cubreobjetos está preparado. En general, para las neuronas corticales que la preparación de platos recubiertos con 500 mg / ml o 1 mg / ml. Agregue suficiente ácido poli-L-lisina solución (hecho en tampón borato) para cubrir completamente el fondo del plato. Si cubreobjetos de vidrio es necesario, asegúrese de que estén completamente sumergidos en la solución de poli-L-lisina. Incubar durante al menos 12 horas. Antes de usarlo, enjuague los platos con una cantidad abundante de agua estéril 3 veces, 5 minutos cada uno. </li><li> HBSS caliente se utiliza para limpiar el tejido descongelado, así como para disociar el tejido en suspensiones celulares. El volumen de HBSS necesario variará en función de la cantidad de tejido para ser descongelados, pero por lo general un criovial va a diluir en 50 ml de HBSS y se disocia en 10 ml de HBSS. </li><li> Modificado por Dulbecco medio de Eagle con 10% suplementado con hierro de suero bovino ternero (EBS) y el 1% antibiótico / antimicótico (AA) mezcla (DMEM (++)) debe ser colocado en un baño de agua 37 ° C. </li><li> Medio chapado (NB (+++)) debe ser fresca antes de su uso. Este medio se prepara añadiendo 1% antibiótico / antimicótico más B27 y los suplementos de N2. </li></ol> Nota: Los nombres de los medios de comunicación adjunta con cruces (+) indican la inclusión de aditivos a la base de la composición de los medios de comunicación. En este texto, DMEM (+ +) denota DMEM más 10% de EBS más el 1% de AA, mientras que denota (+++) NB NB plnos del 1% de AA, además B27 además de N2. Descongelación y cultivo <ol><li> Retire la crioviales del tanque de nitrógeno líquido y descongelación rápida a 37 º C al baño maría hasta sólo una pequeña bolita de hielo es observado dentro de los contenidos vial. </li><li> Suavemente transferir el contenido del vial de 50 ml de HBSS caliente en un tubo cónico. Utilice una punta de orificio amplio para desalojar suavemente cualquier resto de los bloques de tejido atrapado en el criovial. Invierta el tubo 3-4 veces y permitir que el tejido de recoger poco a poco en la parte inferior. Tejidos deben resolver rápidamente, pero si los bloques son demasiado pequeños como este no puede ocurrir y la luz centrifugación (~ 200 x g) se recomienda. </li><li> Aspirar HBSS exceso. </li><li> Agregar 10 ml de HBSS caliente al precipitado de tejido y 300 L de 0,25% de tripsina y 50 L de ADNasa. Incubar en un baño de agua 37 ° C durante 5 minutos, luego coloque en un agitador orbital conjunto de 80 rpm y 37 ° C durante 5 min. </li><li> Después de este período, traer los bloques de tejido en una cabina de seguridad biológica y la utilización de una pipeta 10 ml de agitar cuidadosamente los bloques de tejido hasta obtener una suspensión de células se forma nubes. Desactivar la tripsina mediante la adición de 10 ml de agua tibia DMEM (+ +) a la suspensión celular. </li><li> Centrifugar las células disociadas a 1200 x g por 5 min. Aspirar y desechar el sobrenadante, resuspender el botón celular en 10 ml de agua tibia DMEM (+ +) y cuantificar el número de células con un hemocitómetro. </li><li> Células de la placa de poli-L-lisina platos recubiertos. Por lo general, un plato de 60 mm será plateado con 1x10 6 células. </li><li> Permitir que las células se adhieren a la placa / cubreobjetos durante aproximadamente 1 hora en el cultivo de tejidos incubadora. Se recomienda monitorear el progreso del archivo adjunto en una placa cada 10 minutos hasta que adjunto efectiva que se observa. Entonces, suavemente reemplazar el medio con DMEM fresco (++). </li><li> Después de 24 horas, cambie el DMEM (+ +) con agua tibia (+++). NB Cambios parciales de media (50%) se llevan a cabo cada 5 días con nuevas (+++). NB Culturas saludables por lo general muestran signos de diferenciación y el crecimiento de los procesos después de 24 hrs. En estas condiciones, y realizar cambios parciales de medio cada 4-5 días, los cultivos se pueden mantener por periodos prolongados de tiempo de hasta 4-6 semanas. </li><li> Para la generación de células precursoras neuronales (CPN), un protocolo similar se utiliza con la excepción de que después de la centrifugación, DMEM sin EBS se utiliza. Las células se colocan en el T-25 frascos en DMEM/F12 (01:03), complementado con B27 y EGF (20 ng / mL) para permitir la formación de neuropheres. Para diferenciar los NPCs, neuroesferas se colocan en laminina (10 ug / mL) en cubreobjetos recubiertos DMEM/F12 (1:3) suplementado con N2. </li></ol> 3. Resultados representante Culturas sano muestra un importante crecimiento y la diferenciación de los 5 días post-descongelación y por lo general se estabiliza en su crecimiento por 10 días (Figura 1). Tinción Immuncocytochemical de estas culturas revela numerosos astrocitos (Figura 2A) y neuronas (Figura 2B) para los humanos y de rata cultivos neuronales primarios. Este protocolo también es adecuado para la generación de NPCs como de libre flotación neuroesferas (Figura 3), que en condiciones de diferenciación, el resultado en las culturas mixtas de alta calidad (Figura 3 B, C). <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Los cultivos de células congeladas de tejido cortical humano. Bloques congelados de tejido cortical humano se descongelan y se sembraron en poli-lisina cubreobjetos recubiertos y crecido durante 10 días. El día 5 la expansión celular es evidente y el día 10 de confluencia se logra. Barra de escala: 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Inmuno tinción de los cultivos celulares. (A) los cultivos fueron teñidas con el marcador de proteína glial fibrilar glial ácida (GFAP, flechas gruesas). (B) Las neuronas se detectaron con el marcador neuronal beta-tubulina III (TIII, flechas delgadas). (C) Los dos humanos y las culturas de ratas muestran células gliales y las neuronas abundantes después de 10 días de cultivo. Anticuerpos primarios: el ratón anti-GFAP (1:1000) y el conejo anti-TIII (1:1000). Secundaria de anticuerpos: anti-ratón Alexa 594 (1:500) y anti-conejo Alexa 488 (1:500). Tinción de los núcleos: Hoestch azul (1:1000). Barra de escala: 50 micras. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Generación de neuroesferas. (A) El tejido congelado fue procesada como se describió anteriormente y se permite que se propagan como neuroesferas. (B) neuroesferas se cultivaron en cubreobjetos de vidrio en condiciones de diferenciar y crecido durante 10 días, dando lugar a células que migran fuera de la neuroesfera. (C) Tanto las neuronas y los astrocitos están presentes en la periferia en expansión de una neuroesfera diferenciador. Contratinción nuclear, los anticuerpos primarios y secundarios utilizados como en la figura 2.

<ol><li>Robbins, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human brain tissue.</a> Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).</li>
<li>Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled-rate+freezing+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Controlled-rate freezing of human ES cells.</a> Biotechniques. 38, 879-880 (2005).</li>
<li>Paynter, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+practical+issues+for+cryopreservation+of+nerve+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells.</a> Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).</li>
<li>Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+stromal+vascular+fraction+of+adipose+tissue+in+a+serum-free+freezing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium.</a> J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).</li>
</ol>

Criopreservación ofrece la oportunidad de banco preciosas muestras de tejido cerebral para uso futuro. Aquí se describe un protocolo sencillo pero eficaz para generar tanto neuronas enriquecido las culturas y las células precursoras neuronales a partir de bloques congelados de tejido cerebral. Este procedimiento evita los costos económicos de las técnicas de criopreservación tradicionales que utilizan más caro velocidad controlada congeladores. El protocolo permite la generación de cultivos neuronales viable después de la descongelación, proporcionando un medio rápido pero efectivo para congelar bloques de tejido. El proceso de congelación completa puede tomar tan poco como 20 minutos. Además de los cultivos primarios de neuronas, usando este método de bloques de tejido también se pueden descongelar para generar NPCs crecido como neuroesferas libre flotación. En este sentido, la falta de suero en nuestro medio de congelación asegura que las células se conservan en un estado indiferenciado. En condiciones de diferenciación, neuroesferas producido a partir de la expansión del tejido congelado y las tasas muestran una diferenciación muy comparable a la generada a partir de neuroesferas tejido fresco.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;Medio de Eagle modificado (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td>Alta glucosa 1X</td></tr><tr><td>Suero de ternera suplementado</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td>Para el medio de cultivo </td></tr><tr><td>Medio Neurobasal-A (1X), líquido</td><td>Invitrogen</td><td>1088-022</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Suplemento para medio Neurobasal</td></tr><tr><td>Suplemento N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Suplemento para medio Neurobasal</td></tr><tr><td>Tripsina (10X)</td><td>Cellgro</td><td>25-054CI</td><td>Disociación de tejidos</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa 1 de páncreas bovino (DNasa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-30KU</td><td>Disociación de tejidos</td></tr><tr><td>Solución Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) (10X)</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14065</td><td>Limpieza del tejido, lavados y medio de congelación</td></tr><tr><td>Polilisina-L- 500 mg</td><td>Invitrogen</td><td>P2636</td><td>Sustrato para la adhesión de células neuronales</td></tr><tr><td>antibiótico-antimicótico (100X), líquido</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Para prevenir la contaminación</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de orificio grande (1-200 µl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-141</td><td>Para prevenir el estrés por cizalladura en las células</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta graduadas (101-1000 µl)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>21 agujas guía de precisión G1</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td>Para limpiar el tejido</td></tr><tr><td>Pipeta de 10 ml </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1071-0810</td><td>Envueltos individualmente</td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>926-9-04</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de afeitar de borde único</td><td>Smith &amp;amp; Nephew Inc.</td><td>67-0238</td><td>Para trocear tejido</td></tr><tr><td>Placa de Petri de poliestireno de 60 x 15 mm </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td>Para cultivo general</td></tr><tr><td>placa de Petri de poliestireno de 100 x 15 mm </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0010</td><td>Para limpiar el tejido</td></tr><tr><td>Caja criogénica </td><td>Nalge Nunc international</td><td>5026-1010</td><td></td></tr><tr><td>Contenedor de congelación</td><td>Nalge Nunc International</td><td>5100-0001</td><td>&quot;Mr. Frosty&quot;</td></tr><tr><td>Viales criogénicos de 2,0 ml</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td>Para el medio de congelación</td></tr><tr><td>Etanol al 200 grados</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Para esterilizar la cuchilla de afeitar</td></tr></tbody></table>

la criopreservación de tejido cortical bloques para la generación de cultivos neuronales altamente enriquecido

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

En este estudio, se describe un protocolo estandarizado para la criopreservación exitosa y descongelación de bloques de corteza de tejido cerebral para generar altamente enriquecido cultivos neuronales. Para este protocolo el medio de congelación utilizado es del 10% dimetilsulfóxido (DMSO) diluido en solución salina tamponada de Hank (HBSS). Los bloques de tejido cortical se transfieren a crioviales que contiene el medio de congelación lenta y congelados a -1 ° C / min en un recipiente de congelación de velocidad controlada. Después de la descongelación de procesamiento y la disociación de los bloques de tejido congelado producido constantemente neuronal enriquecido con las culturas que mostraron un crecimiento neurítico rápido durante los primeros 5 días de la cultura y la significativa expansión de la red neuronal dentro de 10 días. Tinción inmunocitoquímica con el marcador de astrocitos proteína glial fibrilar ácida (GFAP) y el marcador neuronal beta-tubulina III clase, reveló un gran número de neuronas y astrocitos en los cultivos. Generación de células precursoras neuronales culturas después de la disociación del tejido bloque resultó en rápida expansión neuroesferas, que produjo un gran número de neuronas y astrocitos en condiciones de diferenciar. Este protocolo de crioconservación simple permite la conservación es rápido, eficaz y de bajo costo de los bloques de tejido cerebral cortical, que otorga una mayor flexibilidad para la última generación de cultivos de células neuronales, astrocitos, y precursoras neuronales.

Aquí se describe un método eficiente para la criopreservación y descongelación de bloques de corteza de tejido cerebral para generar altamente enriquecido cultivos neuronales. Este sencillo protocolo proporciona flexibilidad para la generación posterior de cultivos de células neuronales, astrocitos, y precursoras neuronales.

La criopreservación de tejido cortical Bloques para la generación de cultivos neuronales altamente enriquecido

En este estudio, describimos un protocolo estandarizado para la criopreservación y descongelación exitosas de bloques de tejido cerebral cortical con el fin de generar...

Hola, mi nombre es Alan y soy del laboratorio del Dr. Horney Lu en la Universidad de California en Irvine, en el Departamento de Neurobiología y Conducta. Y yo soy Bob. Hoy, el Dr. Haro les mostrará un protocolo rápido, eficiente y confiable para la criopreservación rutinaria de bloques de tejido cortical, con el fin de obtener posteriormente cultivos primarios de neuronas de alta calidad.Así que comencemos. El tejido limpio y troceado se carga en viales criogénicos que contienen un medio de congelación con un 10% de TMSO.Los viales criogénicos se cargan en un recipiente de congelación y se colocan a menos 80 grados Celsius durante al menos cuatro horas. Luego, los viales criogénicos congelados se colocan en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Para el cultivo, el vial criogénico de AC se derrite en un baño de agua tibia y se enjuaga con HBSS tibio para eliminar el DMSO residual.Se agrega HBSS fresco junto con tripsina para la disociación, después de lo cual se añade DMM con 10% EBS. Para detener la actividad enzimática disociativa, las células se centrifugan y el sedimento se resuspende en DMM fresco más 10% EBS y se siembran en placas recubiertas previamente con polilisina. Después de 24 horas, el DMM se cambia a un medio neurobasal suplementado y se cultiva durante 10 días.Este protocolo utiliza una cuchilla de acero para cortar el tejido cortical antes de su uso. La cuchilla debe esterilizarse en etanol al 70 % durante al menos dos horas. Una solución salina tamponada con Hank (HBSS) 1 x se prepara diluyendo una solución concentrada 10 x en agua esterilizada; luego, la solución 1 x HBSS se mantiene en hielo o a cuatro grados Celsius hasta el procesamiento del tejido.El óxido sulfúrico dimetílico o DMSO se utiliza como crioprotector en el medio de congelación. Este protocolo utiliza una dilución al 10% en volumen de DMSO en H-B-S-S-D-M-S-O 1X, que debe mezclarse completamente antes de almacenarlo a cuatro grados Celsius. Se utiliza un contenedor de congelación Nalgene para controlar la velocidad de congelación de las muestras.El contenedor de congelación se carga con viales criogénicos de 2,5 mililitros que han sido etiquetados previamente. También es recomendable etiquetar los propios contenedores de congelación si se tiene más de uno y anotar el contenedor correspondiente en la bilis. El medio de congelación con DMSO al 10 %, previamente enfriado, junto con el contenedor de congelación, se introducen en una cabina de seguridad biológica estéril.Aquí se agrega lentamente un mililitro de medio de congelación a cada uno de los viales criogénicos. Después de asegurarse de que las tapas estén bien sujetas, coloque el recipiente de congelación con los viales a cuatro grados Celsius durante al menos dos horas, justo antes del procesamiento del tejido. La cuchilla de afeitar previamente esterilizada debe enjuagarse completamente. Tres lavados de tres minutos cada uno.El uso de agua esterilizada debería ser suficiente para eliminar cualquier etanol residual. Este procedimiento de lavado debe ser rápido, ya que la cuchilla es propensa a la oxidación por inmersión prolongada en agua estéril. Antes de la limpieza, el tejido debe colocarse sobre una bolsa de hielo.Lave ligeramente con una X-H-B-S-S fría para eliminar cualquier residuo suelto. Se utilizan agujas esterilizadas para limpiar los fragmentos de tejido de cualquier membrana o vaso sanguíneo residual. Es necesario tener cuidado para preservar la integridad estructural del tejido durante la limpieza.Conforme aumente esto, la eficiencia del picado de tejido limpio será visiblemente diferente a la del tejido crudo y debería tener la mayoría de las membranas o vasos sanguíneos eliminados. Una vez que el tejido haya sido limpiado y enjuagado, puede comenzar el picado. Es importante realizar cortes limpios del tejido, creando bloques de aproximadamente un milímetro cúbico de tamaño.Los bloques que son demasiado grandes producen un rendimiento celular más bajo al descongelarlos. Sin embargo, en los bloques más pequeños también debe evitarse el procesamiento excesivo. Los tejidos picados pueden recolectarse utilizando una pipeta automática y algo de medio H-B-S-S frío al 1X.Asegúrese de enjuagar el recipiente con HBSS para recuperar todo el tejido recolectado. Luego, el tejido se añade a un volumen grande de HBSS 1X y se deja sedimentar hasta el fondo, formando un precipitado suelto. Esto elimina cualquier resto residual que pueda estar presente mientras el tejido se asienta en el HBSS; recupere el recipiente para congelación previamente enfriado y los viales criogénicos antes de distribuir el tejido.Asegúrese de destapar todos los viales para acelerar el proceso de llenado del tejido. La exposición al DMSO a temperatura ambiente debe limitarse a no más de 10 minutos. Es recomendable trabajar con un recipiente de congelación a la vez hasta que todo el tejido haya sido utilizado.Comience a aspirar el sobrenadante de un tejido suelto, acercándose lo más posible al precipitado sin perturbarlo. Luego, coloque una punta de pipeta con orificio ancho de 200 microlitros. No utilice una punta con orificio más pequeño, ya que comprometería la estructura de los bloques que van al fondo del precipitado del bloque de tejido.Recolecte 200 microlitros de tejido lentamente. Añada este tejido a un vial criogénico y continúe con el siguiente hasta que todos los viales estén llenos. Podría ser necesario aplicar una regla de 10 minutos.Coloque rápidamente el recipiente de congelación en viales criogénicos dentro de un congelador a menos 80 grados Celsius durante al menos cuatro horas o durante la noche si el tiempo es limitado. Después de un tiempo suficiente, retire el recipiente de congelación del congelador y distribuya los viales criogénicos en una caja criogénica lo más rápidamente posible. Coloque la caja criogénica en un estante de caja de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.Retire un vial criogénico del nitrógeno líquido lo más rápidamente posible, limitando la exposición de las cajas criogénicas a la temperatura ambiente; derrita rápidamente la muestra sumergiéndola en un baño de agua a 37 grados Celsius. Mantenga siempre la tapa por encima del agua. Revise con frecuencia y continúe el descongelamiento hasta que se observe un pequeño trozo de hielo.Antes de introducirlo en el gabinete de seguridad, esterilice el vial criogénico con etanol al 70 %. Proceda a añadir el tejido descongelado a un volumen grande de HBSS tibio al 1X si queda tejido en las paredes del vial criogénico. Recójalo suavemente con HBSS.Una vez que se haya recolectado todo el tejido, invierta el tubo de tres a cuatro veces y deje que el tejido se sedimente en el fondo. Este paso asegura una dilución suficiente del DMSO.Una vez que el tejido esté asentado, aspire tanto del sobrenadante como sea posible. A continuación, agregue 10 mililitros de H-B-S-S fresco y tibio 1X a este. Añada 300 microlitros de tripsina al 0,25 % y 50 microlitros de DNasas.Proceda a disociar el tejido con agitación suave, creando una suspensión celular turbia tras la disociación del tejido. Detenga la actividad enzimática añadiendo DMEM caliente más suero bovino enriquecido al 10 %, y centrifugue las suspensiones celulares a 1200 ×g durante cinco minutos. Reuspenda el sedimento celular en DMEM fresco más EBS al 10 % y siembre en placas recubiertas con polilisina.Deje que las células se adhieran a las placas durante 30 minutos. Luego, reemplace el medio con DM fresco más 10 % de EBS. Después de 24 horas, sustituya el medio que contenía DM por medio neurobasal suplementado con N dos y B 27 y cultive durante 10 días.Acabamos de detallar un protocolo amplio, eficiente y confiable con una preservación criogénica rutinaria de bloques de tejido cortical. Así que mucha suerte.

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Investigación

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Neurociencia

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En este estudio, proporcionamos una técnica detallada para un sistema de cultivo de organoides corticales simple pero robusto utilizando cultivos hPSC estándar sin alimentador. Este es un protocolo rápido, eficiente y reproducible para generar organoides que modelan aspectos de la senescencia cerebral in vitro.

Generación robusta y altamente reproducible de organoides cerebrales corticales para modelar la senescencia neuronal cerebral in vitro

Un stock congelado de neuronas listo para usar es una herramienta poderosa para evaluar las funciones sinápticas. Aquí, introducimos un cultivo primario fácil de baja densidad a partir de material congelado utilizando una placa de 96 pocillos.

Cultivo primario de baja densidad fácil y reproducible utilizando existencias congeladas de neuronas embrionarias del hipocampo

Aprende a criopreservar bloques de tejido cortical para generar cultivos neuronales enriquecidos. Este protocolo utiliza DMSO al 10% y nitrógeno líquido para mantener la viabilidad celular a largo plazo.

La criopreservación de tejido cortical Bloques para la generación de cultivos neuronales altamente enriquecido

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