La criopreservación de tejido cortical Bloques para la generación de cultivos neuronales altamente enriquecido

Hola, mi nombre es Alan y soy un laboratorio del Dr. Horney Lu en la Universidad de California Irvine en el Departamento de Neurobiología y Comportamiento. Y yo soy Bob. Hoy, el Dr. Haro le mostrará un protocolo rápido, eficiente y confiable para la criopreservación rutinaria de bloques de tejido cortical para la posterior degeneración de cultivos neuronales primarios de alta calidad.

Así que comencemos. El tejido limpio y picado se carga en viales criogénicos que contienen un 10% de TMSO. Medio de congelación.

Los viales criogénicos se cargan en un contenedor de congelación y se colocan a menos 80 grados centígrados durante al menos cuatro horas. A continuación, los viales criogénicos congelados se colocan en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Para el cultivo, el vial criogénico de CA se funde en un baño de agua tibia y se enjuaga con HBSS tibio para eliminar el DMSO restante.

Se añade HBSS fresco junto con la prueba de disociación, después de lo cual se añade DMM con 10%EBS. Para detener la actividad enzimática disociativa, las células se centrifugan y el pellet se resuspende en DMM fresco más 10% EBS y se recubre en placas de polilisina prerrecubiertas. Después de 24 horas, el DMM ha cambiado a un medio neurobasal suplementado y ha crecido durante 10 días.

Este protocolo utiliza una cuchilla de afeitar de acero para cortar el tejido cortical antes de su uso. La maquinilla de afeitar debe esterilizarse en etanol al 70% durante al menos dos horas. Una solución salina tamponada HBSS de Hank se crea diluyendo una solución madre 10 x en agua esterilizada, la X-H-B-S-S se mantiene en hielo o a cuatro grados centígrados hasta el procesamiento del tejido.

El óxido de dimetilsulfo o DMSO se utiliza como crioprotegido en los medios de congelación. Este protocolo utiliza un 10% de volumen y dilución de volumen de DMSO en un X-H-B-S-S-D-M-S-O debe mezclarse completamente antes de almacenarlo a cuatro grados centígrados. Nalgene y el recipiente de congelación se utilizan para controlar la velocidad de congelación de las muestras.

El contenedor de congelación se carga con viales criogénicos de 2,5 mililitros que han sido etiquetados de antemano. También es una buena idea etiquetar los recipientes de congelación si tienes más de uno y anotar el recipiente correspondiente en la bilis. Los medios de congelación previamente enfriados al 10% de DMSO, así como el recipiente de congelación, se introducen en un armario de seguridad biológica estéril.

Aquí, se agrega lentamente un mililitro de medio de congelación a cada uno de los viales criogénicos. Después de asegurarse de que las tapas estén seguras, coloque el recipiente de congelación con los viales a cuatro grados centígrados durante al menos dos horas justo antes del procesamiento del tejido. La hoja de afeitar previamente esterilizada debe enjuagarse a fondo. Lavados de tres, tres minutos.

El uso de agua esterilizada debería ser suficiente para eliminar cualquier resto de etanol. Este procedimiento de lavado debe ser rápido ya que la maquinilla de afeitar es propensa a la oxidación por inmersión prolongada y agua estéril. Antes de la limpieza, se debe colocar un pañuelo de papel sobre una bolsa de hielo.

Enjuague ligeramente con agua fría X-H-B-S-S para eliminar cualquier residuo que flote libremente. Las agujas esterilizadas se utilizan para limpiar las piezas de tejido de las membranas y vasos sanguíneos restantes. Se debe tener cuidado para preservar la integridad estructural del tejido durante la limpieza.

A medida que esto aumente, la eficiencia de cortar el tejido limpio será visiblemente diferente a la del tejido crudo y se deben eliminar la mayoría de las membranas o vasos sanguíneos. Una vez que se ha limpiado y enjuagado un pañuelo, se puede comenzar a picar. Es importante hacer cortes limpios del tejido, creando bloques de aproximadamente un milímetro de tamaño cúbico.

Los bloques que son demasiado grandes tienen un nivel de menor rendimiento de celda en la descongelación. Sin embargo, también se debe evitar el sobreprocesamiento de los bloques más pequeños. El tejido picado se puede recoger con una pipeta automática y una fresca X-H-B-S-S.

Asegúrese de enjuagar el plato con HBSS para recuperar todo el tejido recolectado. A continuación, se añade tejido a un gran volumen de un X-H-B-S-S y se deja caer al fondo, creando una bolita suelta. Esto limpia cualquier residuo restante que pueda estar presente a medida que el tejido se asienta en el HBSS, recupera el recipiente de congelación previamente enfriado y los viales criogénicos antes de asignar el tejido.

Asegúrese de destapar todos los viales para acelerar el proceso de llenado del tejido. La exposición al DMSO a temperatura ambiente no debe limitarse a más de 10 minutos. Es una buena idea trabajar con un recipiente de congelación a la vez hasta que se haya utilizado todo el pañuelo.

Comience a aspirar el supernado de un tejido suelto, granulado de maíz lo más cerca posible del pellet sin perturbarlo. A continuación, coloque una punta de orificio de 200 microlitros de ancho en una pipeta. No utilice un orificio de punta más pequeño, ya que comprometerá la estructura de los bloques que van a la parte inferior de la bolita de bloque de tejido.

Recoja 200 microlitros de tejido lentamente. Agregue este tejido a un vial criogénico y pase al siguiente hasta que todos los viales estén llenos. Es posible que necesite una regla de 10 minutos.

Coloque rápidamente el recipiente de congelación en viales criogénicos a un congelador de 80 grados centígrados negativos durante al menos cuatro horas o toda la noche si el tiempo es limitado. Después de suficiente tiempo, retire el recipiente de congelación del congelador y asigne los viales criogénicos a una caja criogénica lo más rápido posible. Coloque la caja criogénica en un estante de caja de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

Retire un cryo vil del nitrógeno líquido lo más rápido posible, limitando las cajas criogénicas La exposición a la temperatura ambiente derrita rápidamente la muestra sumergiéndola en un baño de agua a 37 grados centígrados. Siempre manteniendo el tapón por encima del agua. Revise con frecuencia y mantenga el descongelamiento hasta que se observe un pequeño P de hielo.

Antes de llevarlo al armario de seguridad, esterilice el cryo vile con etanol al 70%. Proceda a agregar el pañuelo de descongelación a un gran volumen de uno caliente X-H-B-S-S si queda tejido en las paredes del cryo vile. Se recoge suavemente con HBSS.

Una vez recogido todo el tejido. Invierta el tubo tres o cuatro veces y deje que el tejido se asiente en el fondo. Este paso asegura una dilución suficiente de DMSO.

Una vez que el tejido se haya asentado, aspire la mayor cantidad posible de supernatina. Luego agregue 10 mililitros de uno fresco y tibio X-H-B-S-S a esto. Añadir 300 microlitros de tripsina al 0,25% y 50 microlitros de ADN.

Proceda a disociar el tejido con una agitación suave, creando una suspensión celular turbia después de que el tejido se disocie. Detenga la actividad enzimática añadiendo suspensiones de células de centrifusión EPS EPS de suero bovino tibio tibio tibio a más del 10% a 1200 G durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet de celda en DMEM nuevo más 10% EBS y placa en placas recubiertas de polilisina.

Deje que las celdas se adhieran a los platos durante 30 minutos. A continuación, sustituya los medios por DM nuevo más 10%EBS. Después de 24 horas, reemplace los medios contenidos en DM con medios neurobasales suplementados con N dos y B 27 y crezca durante 10 días.

Acabamos de detallar un protocolo vasto, eficiente y confiable con una preservación rutinaria del llanto de los bloqueos de tejido cortical. Así que buena suerte.