JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 6:05 min • August 29th, 2025
Asegure una rata embarazada anestesiada con su útero expuesto que contiene embriones preneurulantes. En esta etapa, la placa neural está abierta y expuesta directamente al líquido amniótico.
Coloque los embriones seleccionados en una placa de Petri con una membrana elástica para estabilizarlos. Asegure los embriones y aplique solución salina para hidratar.
Alinee la sonda de ultrasonido sobre el embrión y mida el diámetro de la cavidad amniótica para calcular el volumen óptimo de inyección.
Coloque una aguja de nanoinyección que contenga una solución lentiviral de alto título sobre el embrión objetivo en un ángulo casi perpendicular.
Inyecte un pequeño volumen preciso en la cavidad amniótica, retraiga suavemente la aguja y retire la sonda de ultrasonido.
Empuje suavemente los embriones hacia el interior del ratón.
El lentivirus inyectado se fusiona con las células de la placa neural, liberando su material genético, que se somete a una transcripción inversa en ADN y se integra en el genoma del huésped.
Esto permite una manipulación genética estable en las células de la placa neural, lo que respalda posibles aplicaciones terapéuticas.
Con fórceps, sostenga el tejido entre los embriones y saque con cuidado ambos cuernos uterinos del abdomen. Cuente y numere los embriones, ya sea desde el ovario hasta el cuello uterino o desde el cuello uterino hasta el ovario, en ambos lados.
A continuación, con un hisopo de algodón húmedo, empuje suavemente todos los embriones hacia la cavidad abdominal, excepto los tres primeros que se inyectarán. Luego, coloque una gota de PBS sobre una membrana elástica pegada a la abertura central redonda de una placa de Petri modificada disponible comercialmente y sosténgala inmediatamente encima de los embriones. Inserte fórceps cerrados en la incisión del elástico, luego suelte los fórceps para abrir la incisión elástica, dejando caer el líquido sobre los embriones.
Con fórceps, tire de la sección del útero correspondiente a los tres embriones a través del elástico y coloque suavemente la placa de Petri en el abdomen del ratón. Con cuatro pies de arcilla, asegure y sujete la placa de Petri por encima del abdomen para reducir la presión sobre el ratón y también reducir la sensibilidad de las imágenes a la respiración y los latidos del corazón del ratón. Luego, con fórceps y un hisopo de algodón húmedo, ajuste el útero y el elástico para asegurarse de que el elástico esté sellado alrededor de la piel del ratón, evitando fugas de PBS.
A continuación, para fijar el útero, presione el cilindro de arcilla de modelar hacia abajo a la derecha de los embriones o el útero y agregue PBS a la placa de Petri hasta que los embriones y el útero estén completamente cubiertos con el PBS. Para facilitar el registro de las inyecciones, sumerja la sonda de ultrasonido en el PBS y ajuste el ratón o la mesa quirúrgica para que el primer embrión esté alineado con la sonda de ultrasonido. Escanee los tres embriones e inspeccione las cavidades amnióticas.
Luego, usando la máquina de ultrasonido, mida el diámetro de la cavidad amniótica para determinar el volumen de inyección apropiado. Usando el controlador de inyección, configure los volúmenes de inyección determinados y la velocidad de inyección en lento, con una velocidad de inyección de 23 nanolitros por segundo. Después de bajar la aguja en el PBS, usando las ruedas principales del sistema de rieles, presione Vaciar en el controlador del nanoinyector hasta que el líquido llegue a la punta de la aguja.
Luego, levante la aguja del PBS y presione Inyectar para verificar que se descargue una gota del volumen deseado aproximado. Baje la aguja en el PBS nuevamente y mueva el nanoinyector con la rueda del plano Y en el micromanipulador para alinear la aguja con la sonda de ultrasonido y el embrión. Ajuste el ángulo de la aguja con la rueda de ángulo de inyección para garantizar un ángulo de inyección casi perpendicular en relación con la pared uterina.
Luego, usando la rueda de inyección en el micromanipulador, inserte la aguja en la cavidad amniótica con un solo movimiento. Si la punta de la aguja desaparece de la imagen de ultrasonido, mueva la sonda hacia adelante o hacia atrás para volver a enfocar la aguja. Luego, inyecte el volumen deseado presionando Inyectar el número apropiado de veces.
Después de inyectar el volumen requerido, espere de 5 a 10 segundos antes de retraer la aguja con un movimiento suave.
A continuación, levante la sonda de ultrasonido y la aguja del PBS con el micromanipulador, alejando la aguja del operador para evitar daños y lesiones.
Con fórceps, vuelva a colocar el primer y segundo embrión en el abdomen empujándolos suavemente a través del elástico.
Después de que se hayan inyectado todos los embriones con cavidades amnióticas óptimas, empuje suavemente los embriones y el útero hacia el abdomen del ratón.