Name: Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Aprende a medir la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero mediante microinyección e hibridación in situ fluorescente. Este método permite cuantificar con precisión el movimiento del ARNm desde el núcleo al citoplasma.

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Nos gustaría agradecer a E. Gomes de consejos útiles y A. Wilde de que nos permite utilizar varios equipos. Este trabajo fue apoyado por una subvención a la AFP desde el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (FRN 102.725).

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<li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li>
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Microinyección es una herramienta poderosa que puede ser usado para estudiar una serie de diferentes procesos celulares. A diferencia de la transfección de células convencionales, microinyección permite al investigador para introducir eficazmente los ácidos nucleicos en los núcleos celulares dentro de un plazo de tiempo muy estrecho. Como resultado, se pueden realizar análisis cinéticos como la determinación de las tasas de exportación del ARNm, la localización de mRNA y síntesis de proteínas. Además, dado que el plazo del experimento es relativamente breve, se puede exponer las células a los compuestos tóxicos en plazos cortos, sin incurrir en efectos pleiotrópicos. Por otra parte, los compuestos inhibidores o estimulantes, como las proteínas dominantes negativas, pueden ser co-inyectados con los ácidos nucleicos. Por último, microinyecciones de evitar la necesidad de reactivos de transfección, que suelen ser tóxicos para las células y puede perturbar diferentes funciones celulares. ARNm frente a las inyecciones de ADN plásmido La elección de qué ácido nucleico para inyectar dependerá de una serie de consideraciones. Después de la inyección de ADN plásmido, ARN polimerasa II no sólo sintetiza ARNm, pero también recluta factores proteicos a la transcripción naciente 12,13. Como estos factores gobiernan los eventos tales como el procesamiento del ARNm, la exportación nuclear y la localización citoplasmática, las inyecciones de ADN del plásmido se puede utilizar para evaluar la forma en la transcripción se acopla a los procesos posteriores. A pesar de la transcripción se puede acoplar a la exportación nuclear 14, hemos encontrado que el ARNm inyectado se exporta un poco más rápido que en el ARNm transcrito vivo 6. Las razones para esto no están claras por el momento, pero este resultado puede sugerir que el ARNm de nueva síntesis se desprende de la ARN polimerasa II, puede ser invertido en complejos que retrasan las exportaciones nucleares. Hay algunas ventajas con inyecciones de ARNm. En primer lugar, el investigador no tiene el uso de inhibidores de la polimerasa de ARN, que pueden afectar a cómo las células regulan el metabolismo general de la ARN. En segundo lugar, el ARN se puede modificar in vitro antes de la inyección. Por ejemplo, el ARNm puede ser sintetizado varios análogos con tapa 5 &#39;o poli (A) longitudes de la cola con el fin de evaluar cómo estas características afectan a las exportaciones nucleares 6. En tercer lugar, la cantidad exacta de ARN que se inyecta puede estimarse aproximadamente. Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, se estima que alrededor de 20.000 a 50.000 moléculas se inyectan en cada uno de los núcleos, que es relativamente pequeño en comparación con el número total de expedientes en una célula típica de mamífero (400.000 a 850.000 moléculas) 15. La principal desventaja con las inyecciones de ARNm es que durante la microinyección, alguna fuga de líquido de la inyección en el citoplasma es inevitable. Desde el ARNm se inyecta directamente en el citoplasma es estable durante largos periodos (A. Palazzo, observación no publicada), el cuidado adicional se debe tomar para seleccionar las células que se han cuantificado. Generalmente se analizan las células que recibieron&gt; 90% de la inyección de fluidos en el núcleo, según la evaluación de la distribución de la OG-dextrano.

<table><tbody><tr><td>Tampón de inyección</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>140 mM KCl y 10 mM HEPES, pH 7.4</td></tr><tr><td>Dextrano Oregon Green 488-70kD</td><td>Invitrogen</td><td>D7173</td><td>El stock de 10 mg/ml en tampón de inyección puede almacenarse durante largos períodos de tiempo a -80&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Tubos capilares de borosilicato</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta para carga de agujas de inyección</td><td>Eppendorf</td><td>022351656</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige International</td><td>NT-88-V3MSH</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa para inyección</td><td>BD Biosciences</td><td>512311</td><td></td></tr><tr><td>Tampón PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td></tr><tr><td>Tampón SSC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>150 mM NaCl, 15 mM citrato sódico, pH 7.4</td></tr><tr><td>Paraformaldehído al 4%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15686</td><td>El stock de paraformaldehído al 37% se diluye en PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100 al 0,1% (Surfact-Amps)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>28314</td><td>El stock de Triton X-100 al 10% se diluye en PBS</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ARNt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>Complejo de ribósido de vanadilo (VRC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3380</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td></td></tr><tr><td>Mesa con control de vibraciones</td><td>Kinetic Systems</td><td>5702E-3036-21</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-amanitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Tractor de micropipetas Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Grasa para vacío</td><td>Dow Corning</td><td>695400008</td><td></td></tr><tr><td>ARN polimerasa T7</td><td>New England Biolabs</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>Poli(A) polimerasa</td><td>Ambion</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de hibridación</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100 mg/ml de sulfato de dextrano, 5 mM VRC, 150 mM NaCl, 15 mM citrato sódico, 0,5 mg/ml de &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ARNt, 60% de formamida</td></tr></tbody></table>

análisis de la cinética de exportación nuclear de arnm en células de mamífero por microinyección

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

En eucariotas, el ARN mensajero (ARNm) se transcribe en el núcleo y debe ser exportado al citoplasma para acceder a la maquinaria de traducción. Aunque la exportación nuclear de ARNm se ha estudiado ampliamente en los ovocitos de Xenopus 1 y los organismos genéticamente tratables como la levadura 2 y la línea celular derivada de Drosophila S2 3, pocos estudios se han realizado en células de mamíferos. Además, la cinética de la exportación de ARNm en células somáticas de mamíferos sólo se podía inferir indirectamente 4,5. Con el fin de medir la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de cultivo de tejidos de mamíferos, hemos desarrollado un ensayo que emplea el poder de la microinyección, junto con la hibridación fluorescente in situ (FISH). Estos ensayos se han utilizado para demostrar que en células de mamíferos, la mayoría de los ARNm se exportan en forma de empalme depende 6,7, o en la forma que requiera que las secuencias específicas de ARN como la región de la secuencia de codificación de la señal (SSCR) 6. En este ensayo, las células se microinyección, ya sea con ARNm sintetizado in vitro o de ADN plásmido conteniendo el gen de interés. Las células se incuban por microinyección de diversos puntos de tiempo se fija y la localización subcelular de ARN se evaluó mediante FISH. En contraste con la transfección, donde la transcripción ocurre varias horas después de la adición de ácidos nucleicos, la microinyección de ADN o ARNm permite la expresión rápida y permite la generación de información precisa sobre la cinética.

A continuación se describe un ensayo que emplea el poder de la microinyección, junto con fluorescentes<em&gt; In situ</emHibridación&gt; con el fin de medir con precisión la cinética de la exportación nuclear de ARNm en células somáticas de mamíferos.

Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

En los eucariotas, el ARN mensajero (ARNm) se transcribe en el núcleo y debe exportarse al citoplasma para acceder a la maquinaria de traducción. Aunque...

El objetivo general de este procedimiento es medir la cinética de la exportación nuclear de ARNm en células de mamífero. Esto se logra primero mediante la microinyección de ARNm o ADN en los núcleos de células en cultivo de tejido de mamífero. Tras la microinyección, las muestras se fijan tras diversos períodos de incubación.El ARNm se tiñe luego mediante hibridación fluorescente in situ o FISH. El paso final del procedimiento consiste en obtener imágenes de las células y cuantificar la cantidad de fluorescencia en el citoplasma y el núcleo. En última instancia, la tasa de exportación de ARNm puede medirse mediante una combinación de microinyección y microscopía fluorescente.Hola, soy SRG AV del laboratorio de Alex Palazzo en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Toronto. Soy Stefan Toski, también del Laboratorio Palazzo. Soy Amy del laboratorio Palazzo y soy Khi Maha David del laboratorio Palazzo.Hoy les mostraremos un procedimiento para introducir ARNm en los núcleos de células de cultivo tisular de mamífero mediante microinyección. También demostraremos cómo teñir el ARNm mediante hibridación fluorescente en dos híbridos. Utilizamos estos procedimientos en nuestro laboratorio para estudiar la cinética de la exportación nuclear del ARNm en células de mamífero.Así que comencemos. Antes de la microinyección, prepare previamente el ADN plasmídico a entre 50 y 200 microgramos por mililitro en tampón de inyección. A continuación, agregue Oregon Green 488 u OG conjugado con dextrano de 70 kilodaltones a la mezcla para permitir la identificación de las células inyectadas.El dextrano conjugado con OG ayudará a determinar cuánto del fluido se inyectó en el núcleo y cuánto se filtró hacia el centrifugado del citoplasma. Centrifugue las muestras a 13.000 G y cuatro grados Celsius durante al menos 20 minutos para obtener un sedimento con cualquier material particulado que pudiera obstruir potencialmente la punta de la aguja. Elija la línea celular de mamífero que se microinyectará según los criterios descritos en el costo del protocolo escrito.Se utilizan siete células para esta semilla de demostración. Las células se colocan sobre laminillas tratadas con ácido en placas de Petri de 30 milímetros al menos 24 horas antes de la microinyección. Idealmente, la monocapa celular debe tener una confluencia aproximada del 70 al 90% en el momento de la inyección para facilitar la identificación de las células inyectadas; la monocapa celular se lesiona previamente a la inyección utilizando una punta de pipeta plástica de 200 microlitros.Trace una herida en forma de cruz en la lámina de cubreobjetos y deje que las células se recuperen en el incubador de cultivo de tejidos durante al menos 15 minutos antes de la inyección. Para la microinyección, utilice un microscopio invertido aislado sobre una mesa de aire para minimizar las vibraciones que podrían interferir con el proceso de microinyección. Utilizando una punta cargadora de geles einor, retire aproximadamente un microlitro de la parte superior de la muestra de centrífuga para evitar perturbar el precipitado.Introduzca la punta de la pipeta en la parte posterior de una aguja de microinyección prefabricada y expulse el líquido. El líquido será absorbido hacia la punta de la aguja por acción capilar. Debe ser visible un menisco cerca de la punta dentro de los cinco a treinta segundos.Coloque la aguja llena de líquido en el soporte y fíjela al micromanipulador. En un ángulo de 45 grados, visualice la aguja utilizando el objetivo de 10 x y colóquela en el centro del campo de visión, cerca del plano focal. Mediante los mandos gruesos del micromanipulador, el soporte se conecta mediante un tubo a una jeringa de vidrio, que se utiliza para generar la presión necesaria para expulsar el líquido desde la punta de la aguja.Para mantener una presión constante, monte la jeringa en una abrazadera para tubo. Utilizando dos tapones de goma y dos abrazaderas metálicas, eleve la aguja unos pocos milímetros para evitar que se dañe en pasos posteriores y luego aleje el microscopio. Columna, aumente la presión presionando el émbolo de la jeringa.De 0,5 a dos centímetros cúbicos. Coloque una placa de Petri que contenga una cubeta con una monocapa dañada. Sobre la platina, aleje el microscopio.Coloque el pilar hacia adelante en posición vertical para alinear el condensador con la aguja y permitir su entrada en el líquido. Esto debe hacerse con cuidado para evitar que la aguja se rompa contra la lámina cubreobjetos. Utilizando el objetivo de 10 x, identifique el centro del cruce de hilos y coloque la aguja por encima de las células que se van a inyectar.Aumente el aumento cambiando al objetivo de 40 x. Luego, baje y centre la aguja utilizando los mandos de ajuste fino del joystick. Comience la inyección en una esquina de la cruz de la herida bajando la aguja hasta que haga contacto con el núcleo.Una vez inyectada, una célula presenta un cambio notable en el brillo de fase. Continúe a lo largo de un borde del corte transversal. Para facilitar la identificación de las células inyectadas durante la visualización, es fundamental que la presión de inyección se ajuste adecuadamente para cada aguja.La presión debe ser lo suficientemente alta como para atravesar las membranas plasmática y nuclear, pero no tan alta que mate las células. Microinyecte células a lo largo del borde de la herida durante un período de tiempo fijo. Con práctica, se pueden inyectar varias cientos de células durante este intervalo.Si se inyecta ADN plasmídico, incubar las células microinyectadas a 37 grados Celsius en un incubador de cultivo de tejidos durante 20 minutos antes de la fijación, luego detener la transcripción. Tratando las células con un microgramo por mililitro de alfa, una mantina disuelta en medio de crecimiento. Esta concentración inhibe eficazmente la transcripción a partir de plásmidos microinyectados.Coloque las células nuevamente en el incubador y permita que exporten el ARNm recién sintetizado. Una sola aguja puede reutilizarse para inyectar varias laminillas. Aunque es necesario reemplazar la aguja cuando cambia el tipo de ADN o ARN que se microinyecta.Además, una vez que la aguja se retira del aplicador, debe desecharse para obtener una medición precisa de la cinética de exportación nuclear de ARNm. Las muestras independientes deben fijarse a los cero minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos. Tras el tratamiento con alfa manina en el momento adecuado, aspire el medio de crecimiento y lave las células dos veces con dos mililitros de solución de PBS.Es importante mantener las laminillas húmedas minimizando el tiempo que permanecen sin estar sumergidas en líquido. Fije las células añadiendo dos mililitros de aldehído al 4% en PBS e incube las células durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las muestras fijadas dos veces más, permeabilice las células con dos mililitros de Triton X-100 al 0,1% en PBS e incube nuevamente las células durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente.Finalmente, lave las muestras dos veces adicionales para prepararlas para la hibridización. Lave las células dos veces con un tampón de lavado compuesto por una solución XSSC al 1 con un contenido de 25 a 60% de formamida. Luego, prepare la cámara de tinción para la hibridización cubriendo el fondo de una placa de Petri de 150 milímetros con agua y colocando una pieza de paraformo flotando en la superficie.Retire el agua invirtiendo el recipiente, lo que permite que el paraformo se adhiera al fondo del recipiente. Retire manualmente cualquier burbuja de aire de cada cubreobjetos que vaya a teñirse. Pipetee gotas de 100 microlitros de la solución de hibridación sobre el paraformo.Tenga en cuenta que la cantidad de formagel debe optimizarse para el pez específico que se esté utilizando, con la ayuda de pinzas. Retire una laminilla con las células fijadas del platillo de Petri de 30 milímetros. Utilizando papel filtro Watman, seque la parte posterior de la laminilla y elimine el exceso de tampón de la cara frontal mediante escarificado, sin secar las células.Luego coloque el cubreobjetos con la cara hacia abajo sobre la solución de pez. Repita este proceso para cada cubreobjetos. Después de colocar nuevamente la tapa de las cámaras de tinción, incube las muestras durante cinco a 18 horas a 37 grados Celsius.Prepare varias cámaras de lavado de la misma manera que se preparó la cámara de tinción; para cada cubreobjetos, pipete un mililitro de tampón de lavado sobre la paraforma de la cámara de lavado. Tras la incubación, retire los cubreobjetos de la cámara de tinción pipeteando un mililitro de tampón de lavado. Junto al cubreobjetos, el líquido debe ser succionado por debajo de cada muestra mediante acción capilar.Luego retire los cubreobjetos con pinzas y coloque cada uno sobre una gota de tampón de lavado incubado a temperatura ambiente durante cinco minutos. Lave cada cubreobjeto otras dos veces, para un total de tres lavados. Para cada cubreobjeto, pipetee de 10 a 30 microlitros de solución de montaje con dappy sobre un portaobjetos previamente lavado. Cada portaobjetos puede alojar dos cubreobjetos utilizando pinzas y papel filtro Watman.Seque el reverso de las laminillas y retire el exceso de líquido del lado frontal de la laminilla sin secar las muestras. Coloque cada laminilla con el lado frontal hacia abajo sobre una gota de solución de montaje. Las muestras montadas pueden almacenarse a cuatro grados Celsius.Aquí se muestran los efectos de la alfa mantina sobre la transcripción del ADN plasmídico inyectado en células de fibroblastos NIH 3T3, que fueron pretratadas con concentraciones variables de alfa mantina. Se inyectaron con el ADN plasmídico TFL s delta i y dextrano conjugado con OG de 70 kilodalton. Cada fila corresponde a un único campo de visión capturado para el dextrano de 70 kilodalton marcado con OG y el ARNm de T uts delta I.Es evidente que altas concentraciones del fármaco inhibieron completamente la producción del transcrito T UTS delta I, mientras que esto no se observó a concentraciones más bajas. Se muestra aquí un curso temporal del costo de exportación nuclear de ARNm. Siete células fueron inyectadas con ADN plasmídico T UTS delta i y dextrano conjugado con OG de 70 kilodaltones.30 minutos después de la inyección, las células se trataron con alfa-mantina y se incubaron a 37 grados Celsius durante cero minutos, 60 minutos y 120 minutos. Luego, las células se fijaron y tiñeron con una sonda contra el ARNm de T UTS delta I y con anticuerpos contra el marcador del RE trap alfa. Cada fila corresponde a un único campo de células.Para obtener información sobre cómo cuantificar la exportación de ARNm, consulte el texto en línea aquí. El punto temporal de 120 minutos se amplió para demostrar la colocalización del ARNm de TFS delta I en el RE; se muestra una superposición del ARNm de T UTS delta I en verde y de la TRAP alfa en rojo. La información sobre cómo teñir simultáneamente ARNm con proteínas está disponible en el texto en línea.Acabamos de mostrarle cómo medir la cinética de exportación nuclear del ARNm mediante microinyección. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que una microinyección exitosa requiere una preparación adecuada. Los pasos clave, como la preparación de ADN y ARN, el acondicionamiento de muestras, la elaboración de agujas, la alineación del equipo óptico y la resolución de problemas de microinyección, se describen en nuestro protocolo escrito.Al realizar imágenes y analizar el ARNm microinyectado, es importante que la cuantificación se limite a células que hayan recibido más del 90 % del líquido inyectado en el núcleo. Una inyección nuclear exitosa puede evaluarse visualizando la distribución del dextrano verde organ en el núcleo y el citoplasma. Consulte nuestro protocolo en línea para obtener más información sobre el diseño de sondas para peces y el uso de software de análisis de imágenes para analizar la distribución del ARNm en el citoplasma y en el núcleo.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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