Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

El objetivo general de este procedimiento es medir la cinética de la exportación nuclear de ARNm en células de mamíferos. Esto se logra primero mediante la microinyección de ARNm o ADN en los núcleos de células en cultivo de tejidos de mamíferos. Tras la microinyección, las muestras se fijan tras diversos períodos de incubación.

El ARNm se tiñe luego mediante hibridación fluorescente in situ o FISH. El paso final del procedimiento consiste en obtener imágenes de las células y cuantificar la cantidad de fluorescencia en el citoplasma y el núcleo. En última instancia, la tasa de exportación del ARNm puede medirse mediante una combinación de microinyección y microscopía fluorescente.

Hola, soy SRG AV del laboratorio de Alex Palazzo en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Toronto. Soy Stefan Toski, también del Laboratorio Palazzo. Soy Amy del laboratorio Palazzo y soy Khi Maha David del laboratorio Palazzo.

Hoy les mostraremos un procedimiento para introducir ARNm en los núcleos de células de cultivo de tejidos de mamíferos mediante microinyección. También demostraremos cómo teñir el ARNm mediante hibridación fluorescente in situ. Utilizamos estos procedimientos en nuestro laboratorio para estudiar la cinética de la exportación nuclear del ARNm en células de mamíferos.

Así que comencemos. Antes de la microinyección, prepare previamente el ADN plasmídico a una concentración entre 50 y 200 microgramos por mililitro en tampón de inyección. A continuación, añada Oregon Green 488 u OG conjugado con dextrano de 70 kilodaltones a la mezcla para permitir la identificación de las células inyectadas.

El dextrano conjugado con OG ayudará a determinar cuánto fluido se inyectó en el núcleo y cuánto se filtró hacia el citoplasma. Centrifugar las muestras a 13.000 G y cuatro grados Celsius durante al menos 20 minutos para formar un precipitado con cualquier materia particulada que pudiera obstruir potencialmente la punta de la aguja. Elegir la línea celular de mamífero que se microinyectará según los criterios descritos en el costo del protocolo escrito.

Se utilizan siete células para esta semilla de demostración. Las células se colocan sobre cubreobjetos tratados con ácido en placas de Petri de 30 milímetros al menos 24 horas antes de la microinyección. Idealmente, la monocapa celular debe tener una confluencia aproximada del 70 al 90 % en el momento de la inyección, lo que permite una fácil identificación de las células inyectadas; la monocapa celular se lesiona previamente a la inyección utilizando una punta de pipeta plástica de 200 microlitros.

Trace una herida en forma de cruz en la cubeta y deje que las células se recuperen en el incubador de cultivo tisular durante al menos 15 minutos antes de la inyección. Para la microinyección, utilice un microscopio invertido aislado sobre una mesa de aire para minimizar las vibraciones que podrían interrumpir el proceso de microinyección. Con una punta cargadora de gel einor, retire aproximadamente un microlitro de la parte superior de la muestra de centrífuga para evitar perturbar el precipitado.

Introduzca la punta de la pipeta en la parte posterior de una aguja de microinyección prefabricada y expulse el líquido. El líquido será absorbido hacia la punta de la aguja por acción capilar. Debe ser visible un menisco cerca de la punta dentro de los cinco a treinta segundos.

Coloque la aguja llena de líquido en el soporte y sujétela al micromanipulador. En un ángulo de 45 grados, visualice la aguja utilizando el objetivo de 10x y colóquela en el centro del campo de visión, cerca del plano focal. Mediante los mandos gruesos del micromanipulador, el soporte se conecta mediante un tubo a una jeringa de vidrio, que se utiliza para generar la presión necesaria para expulsar el líquido desde la punta de la aguja.

Para mantener una presión constante, monte la jeringa en una abrazadera para tubo. Utilizando dos tapones de goma y dos abrazaderas metálicas, eleve la aguja unos milímetros para evitar que se dañe en pasos posteriores y luego aleje el microscopio. Apoyándose en el soporte, aumente la presión presionando el émbolo de la jeringa.

De 0,5 a dos centímetros cúbicos. Coloque una placa de Petri que contenga una cubeta con una monocapa lesionada. En la etapa de visualización, aleje el microscopio.

Coloque el pilar hacia adelante en posición vertical, lo que hace que el condensador se alinee con la aguja para penetrar en el líquido. Esto debe hacerse con cuidado para evitar que la aguja se rompa en el cubreobjetos. Utilizando el objetivo de 10 x, identifique el centro del cruce de hilos y coloque la aguja por encima de las células que se van a inyectar.

Aumente el aumento cambiando al objetivo de 40 x. Luego, baje y centre la aguja utilizando los mandos de ajuste fino del joystick. Comience la inyección en una esquina de la cruz de la herida bajando la aguja hasta que haga contacto con el núcleo.

Una vez inyectada, una célula presenta un cambio notable en el brillo de fase. Continúe a lo largo de un borde del corte transversal. Para facilitar la identificación de las células inyectadas durante la visualización, es fundamental que la presión de inyección se ajuste adecuadamente para cada aguja.

La presión debe ser lo suficientemente alta como para atravesar las membranas plasmática y nuclear, pero no tan alta que mate las células. Microinyecte células a lo largo del borde de la herida durante un período de tiempo fijo. Con práctica, se pueden inyectar varias cientos de células durante este intervalo.

Si se inyecta ADN plasmídico, incubar las células microinyectadas a 37 grados Celsius en una incubadora de cultivo de tejidos durante 20 minutos antes de la fijación, luego detener la transcripción. Tratando las células con un microgramo por mililitro de alfa, una mantina disuelta en medio de crecimiento. Esta concentración inhibe eficazmente la transcripción a partir de plásmidos microinyectados.

Coloque las células de nuevo en el incubador y permita que exporten el ARNm recién sintetizado. Una sola aguja puede reutilizarse para inyectar varias laminillas. Aunque es necesario reemplazar la aguja cuando cambia el tipo de ADN o ARN que se microinyecta.

Además, una vez que la aguja se retira del aplicador, debe desecharse para obtener una medición precisa de la cinética de exportación nuclear de ARNm. Las muestras independientes deben fijarse a los cero minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos. Tras el tratamiento con alfa manina en el momento adecuado, aspire el medio de crecimiento y lave las células dos veces con dos mililitros de solución de PBS.

Es importante mantener las laminillas húmedas minimizando el tiempo que permanecen sin estar sumergidas en líquido. Fije las células añadiendo dos mililitros de aldehído al 4% en PBS e incube las células durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las muestras fijadas dos veces más, permeabilice las células con dos mililitros de Triton X-100 al 0,1% en PBS e incube nuevamente las células durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente.

Finalmente, lave las muestras dos veces adicionales para prepararlas para la hibridación. Lave las células dos veces con un tampón de lavado compuesto por una solución de XSSC al 1 a 25-60% de formamida. Luego, prepare la cámara de tinción para la hibridación cubriendo el fondo de una placa de Petri de 150 milímetros con agua y colocando una pieza de paraformo flotando en la superficie.

Retire el agua invirtiendo el recipiente, lo que permite que el portaobjetos se adhiera al fondo del recipiente. Retire manualmente cualquier burbuja de aire de cada cubreobjetos que vaya a teñirse. Aplique con pipeta gotas de 100 microlitros de la solución de hibridación sobre el portaobjetos.

Tenga en cuenta que la cantidad de formagel debe optimizarse para el pez específico que se esté utilizando, con la ayuda de pinzas. Retire una laminilla con las células fijadas del platillo de Petri de 30 milímetros. Utilizando papel filtro Watman, seque la parte posterior de la laminilla y absorba el exceso de tampón del lado frontal sin desecar las células.

Luego coloque el cubreobjetos con la cara hacia abajo sobre la solución de pez. Repita este proceso para cada cubreobjetos. Después de colocar nuevamente la tapa de las cámaras de tinción, incube las muestras durante cinco a 18 horas a 37 grados Celsius.

Prepare varias cámaras de lavado de la misma manera que se preparó la cámara de tinción; para cada cubreobjetos, pipetee un mililitro de tampón de lavado sobre la paraforma de la cámara de lavado. Tras la incubación, retire los cubreobjetos de la cámara de tinción pipeteando un mililitro de tampón de lavado. Junto al cubreobjetos, el líquido debe ser arrastrado por debajo de cada muestra mediante acción capilar.

Luego retire los cubreobjetos con pinzas y coloque cada uno sobre una gota de tampón de lavado incubado a temperatura ambiente durante cinco minutos. Lave cada cubreobjeto dos veces más, para un total de tres lavados. Para cada cubreobjeto, agregue mediante pipeta de 10 a 30 microlitros de solución de montaje con dappy sobre un portaobjetos previamente lavado. Cada portaobjetos puede alojar dos cubreobjetos utilizando pinzas y papel filtro Watman.

Seque el reverso de las laminillas y retire el exceso de líquido del lado frontal de la laminilla sin secar las muestras. Coloque cada laminilla con el lado frontal hacia abajo sobre una gota de solución de montaje. Las muestras montadas pueden almacenarse a cuatro grados Celsius.

Aquí se muestran los efectos de la alfa mantina sobre la transcripción de ADN plasmídico inyectado en células de fibroblastos NIH 3T3, que fueron previamente tratadas con concentraciones variables de alfa mantina. Se inyectó ADN plasmídico TFL s delta i, y dextrano conjugado con OG de 70 kilodaltones. Cada fila corresponde a un único campo de visión obtenido para el dextrano de 70 kilodaltones marcado con OG y el ARNm de T uts delta I.

Es evidente que altas concentraciones del fármaco inhibieron completamente la producción del transcrito T UTS delta I, mientras que esto no se observó a concentraciones más bajas. Se muestra aquí un curso temporal del costo de exportación nuclear de ARNm. Siete células fueron inyectadas con ADN plasmídico T UTS delta i y dextrano conjugado con OG de 70 kilodaltones.

30 minutos después de la inyección, las células se trataron con alfa-mantin y se incubaron a 37 grados Celsius durante cero minutos, 60 minutos y 120 minutos. Luego, las células se fijaron y se tiñeron con una sonda contra el ARNm de T UTS delta I y con anticuerpos contra el marcador del RE trap alfa. Cada fila corresponde a un único campo de células.

Para obtener información sobre cómo cuantificar la exportación de ARNm, consulte el texto en línea aquí. El punto temporal de 120 minutos se amplió para demostrar la colocalización del ARNm de TFS delta I en el RE; se muestra una superposición del ARNm de T UTS delta I en verde y de la TRAP alfa en rojo. La información sobre cómo teñir simultáneamente ARNm con proteínas está disponible en el texto en línea.

Acabamos de mostrarle cómo medir la cinética de exportación nuclear del ARNm mediante microinyección. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que una microinyección exitosa requiere una preparación adecuada. Los pasos clave, como la preparación de ADN y ARN, el acondicionamiento de muestras, la elaboración de agujas, la alineación del equipo óptico y la resolución de problemas de microinyección, se describen en nuestro protocolo escrito.

Al realizar imágenes y analizar el ARNm microinyectado, es importante que la cuantificación se limite a células que hayan recibido más del 90 % del líquido inyectado en el núcleo. Una inyección nuclear exitosa puede evaluarse visualizando la distribución del dextrano verde organ en el núcleo y el citoplasma. Consulte nuestro protocolo en línea para obtener más información sobre el diseño de sondas para peces y el uso de software de análisis de imágenes para analizar la distribución del ARNm en el citoplasma y en el núcleo.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.