Inyección de péptidos autoensamblables y células precursoras neurales para la reparación de la médula espinal en un modelo de rata

Asegure una rata anestesiada con una lesión de la médula espinal cervical en un marco estereotáctico.

El sitio de la lesión consiste en axones dañados y cavidades llenas de líquido rodeadas de células inmunitarias, células gliales y fibroblastos infiltrados, que dificultan el crecimiento axonal y la recuperación funcional.

Desinfecte y haga una incisión en la piel por encima de la columna vertebral. Diseccionar los músculos para exponer la duramadre, la cubierta externa de la médula espinal.

Extirpe el tejido cicatricial de la duramadre para revelar el sitio de la lesión de la médula espinal.

Coloque una microjeringa sobre la lesión, que contenga péptidos autoensamblables (SAP), e

inyéctelos en el núcleo de la lesión en un lado de la línea media.

Repita la inyección en el lado opuesto para una distribución uniforme.

A continuación, inyecte células precursoras neurales (NPC) en los sitios que rodean la lesión, evitando el núcleo de la lesión inflamada para mejorar la supervivencia de NPC.

Una vez inyectados, los SAP se autoensamblan en un andamio que imita la matriz extracelular y une las cavidades. El andamio apoya la supervivencia de NPC y la diferenciación en células neuronales para la remodelación de tejidos.

La inyección se realiza 14 días después de la lesión de la médula espinal. Antes de comenzar la cirugía, prepare los SAP a una concentración del 1% en peso por volumen en agua estéril y llene un capilar de vidrio de 100 micrómetros conectado a una jeringa Hamilton con la solución.

Conecte la jeringa Hamilton al marco estereotáxico. Después de anestesiar a la rata, coloque la cabeza en el marco estereotáxico y desinfecte el sitio de la cirugía con povidona yodada y alcohol al 70% como antes. Una vez más, después de abrir la piel, disecciona cuidadosamente el par de músculos vertebrales e inserta retractores.

Use un bisturí número 15 para eliminar el tejido cicatricial de la duramadre y volver a exponer el sitio de la lesión. Luego, use la punta de una aguja afilada para abrir la duramadre con cuidado. Finalmente, estereotácticamente, inserte el capilar de vidrio a una profundidad de dos milímetros en la médula espinal traumatizada e inyecte los SAP.

Después de inyectar los SAP, deje que el capilar permanezca en el lugar de la inyección durante un minuto antes de retirarlo para permitir que el tejido se estire para acomodar la solución inyectada. Luego repita la inyección en el siguiente sitio. Aquí, las NPC se aislaron de la zona paraventricular de un ratón rojo DS adulto y se cultivaron de acuerdo con procedimientos publicados anteriormente.

Justo antes de la microinyección, diluya las NPC en medio de crecimiento a una concentración de 50 veces 10 a la tercera célula viva por microlitro para trasplante celular y cárguelas en un capilar de vidrio con una jeringa Hamilton. Los NPC se inyectan inmediatamente después de la inyección de SAP. Para ello, inserte el capilar de vidrio de la jeringa Hamilton a 0,2 milímetros del sitio de la lesión y 1,5 milímetros por debajo de la superficie dorsal de la médula espinal.

Inyecte dos microlitros de la suspensión celular a una velocidad de aproximadamente 0,5 microlitros por minuto. Una vez completada la primera inyección, deje que el capilar permanezca en la médula espinal durante un minuto como antes. Luego retraiga el capilar, muévalo a un sitio adyacente y repita el procedimiento de inyección. Después de esperar un minuto, como antes, retraiga el capilar y muévalo dos milímetros hacia el sitio de la lesión.

Realice dos inyecciones de dos microlitros en este lugar.