Manipulación optogenética de circuitos neuronales para la transición del sueño a la vigilia en ratones

Asegure un ratón anestesiado con un cráneo expuesto en un marco estereotáxico.

El núcleo del lecho cerebral de la estría terminal (BNST) contiene neuronas transducidas viralmente que expresan canales catiónicos sensibles a la luz.

Taladre agujeros en el cráneo, inserte fibras ópticas y asegúrelas con tornillos de soporte y cemento dental.

Taladre orificios adicionales para colocar un conjunto que contenga electrodos de electroencefalografía (EEG) y electromiografía (EMG) y asegúrelo con adhesivo.

Exponga los músculos del cuello para insertar los cables de los electrodos EMG, luego permita la recuperación.

Conecte el mouse a un sistema de grabación, colóquelo en una cámara experimental y déjelo dormir.

Entregar luz a través de la fibra óptica para activar los canales catiónicos sensibles a la luz, desencadenando la afluencia catiónica que genera potenciales de acción.

Las señales se propagan a las regiones reguladoras del sueño y promueven la vigilia.

Registre las señales de EEG para monitorear la actividad cerebral y las señales de EMG para detectar la actividad muscular para observar la transición del sueño a la vigilia.

Para la implantación de electrodos de electroencefalograma, o EEG, y electromiograma, o EMG, primero suelde dos alambres de acero inoxidable de los cuales se haya quitado un milímetro de aislamiento de ambos extremos a los electrodos EMG y coloque el centro de los electrodos en el bregma. Luego marque la posición para cada electrodo de EEG.

Para determinar la posición del implante de fibra óptica, conecte una férula de fibra óptica al manipulador y gire el brazo manipulador en un ángulo de más o menos 30 grados contra una línea horizontal. Coloque la punta de fibra en el bregma y registre las coordenadas. Mueva la punta a la línea de inserción deseada y marque la posición en el cráneo y la posición del tornillo de anclaje junto al sitio de inserción.

Use el taladro dental para perforar el cráneo en cada sitio y use el manipulador para insertar suavemente la fibra óptica hasta que llegue por encima del BNST. La férula debe descansar sobre el cráneo restante. Asegure la fibra al cráneo con un tornillo de anclaje, teniendo cuidado de no romper la duramadre ni dañar ningún tejido.

Luego cubra la fibra y atornille con cemento dental fotocurable. A continuación, taladre agujeros para electrodos de EEG / EMG e inserte la punta del primer electrodo en un orificio. Sosteniendo el implante con una mano, aplique adhesivo de cianoacrilato en el espacio entre el cráneo y el electrodo e inserte el electrodo el resto del camino, teniendo cuidado de no dañar ningún tejido.

Cuando se hayan colocado todos los electrodos, cubra la circunferencia de los electrodos y las fibras ópticas con adhesivo de cianoacrilato adicional y acelerante de cianoacrilato para evitar causar interrupciones en las zonas de conexión de la férula al cable óptico y del electrodo al cable conductor. Ahora exponga los músculos del cuello e inserte los cables para el electrodo EMG debajo del músculo. Ajuste la longitud del electrodo EMG para que quepa justo debajo de los músculos nucales y rellene los implantes con más adhesivo y acelerante de cianoacrilato.

Luego coloque el mouse en una almohadilla térmica con monitoreo hasta la recompensa completa. Para el monitoreo de EEG / EMG durante la fotoexcitación de neuronas objetivo, primero use un escalar para ajustar la intensidad del láser y use una férula para atar la punta del cable láser a una fibra óptica no utilizada. Confirme que no hay espacio en la unión entre la fibra y el cable.

Después de 20 minutos, emita el láser calentado al verificador de intensidad y ajuste la intensidad a 10 milivatios por milímetro cuadrado. Establezca la duración del pulso de luz en 10 milisegundos, el período de descanso en 40 milisegundos, el ciclo en 20 y la repetición en 20. Cambie el modo láser a lógica de transistor y confirme que se emiten pulsos de luz desde la fibra controlada por el regulador de patrón.

Conecte el electrodo implantado y el adaptador de cable, luego cubra la unión con material impermeable a la luz para evitar fugas de láser. Y cuando el láser esté listo, mueva los ratones a la cámara experimental para el registro de EEG / EMG. Para evaluar la latencia a la vigilia por el movimiento ocular no rápido o el sueño con movimientos oculares rápidos, limite el tiempo de grabación y optimice el tiempo de ganancia del sitio y deje que los ratones se muevan libremente en la cámara experimental durante al menos una hora.

Durante el período experimental, monitoree las señales de EEG y EMG en la misma pantalla de grabación. Evalúe el estado del ratón como vigilia, sueño sin movimientos oculares rápidos o sueño con movimientos oculares rápidos utilizando el control de ganancia para cada onda para facilitar la distinción de cada estado. Para medir la latencia del sueño de movimiento ocular no rápido a la vigilia, observe un sueño estable de movimiento ocular no rápido durante 40 segundos, luego encienda el generador de patrones para la fotoestimulación y confirme la emisión de láser a las fibras ópticas implantadas.

Luego registre las señales de EEG / EMG hasta que el estado de sueño cambie a vigilia.