Regeneración axonal en el nervio ciático de un ratón después de una lesión por aplastamiento

Comience con el nervio ciático aislado de un ratón.

Las neuronas dentro del nervio se transfectaron para expresar proteínas citoplasmáticas fluorescentes.

El nervio fue aplastado para inducir una lesión, que fue marcada con una sutura.

Los segmentos de axones lesionados en el sitio se degeneran y los macrófagos reclutados limpian los escombros.

Las células de Schwann proliferan para formar pistas de guía y secretar factores neurotróficos que promueven el crecimiento de los axones. Los axones se extienden a lo largo de estas pistas, regenerando el nervio.

Fije el nervio para preservar las estructuras celulares, luego elimine los tejidos no neuronales adheridos.

Lavar con un tampón para eliminar los fijadores residuales.

Coloque el nervio en un portaobjetos de microscopio, aplique un medio de montaje y coloque un cubreobjetos.

Aplana el nervio para colocar los axones dentro del mismo plano focal para obtener imágenes.

Usando un microscopio de epifluorescencia, rastree los axones desde el sitio de aplastamiento hasta sus extremos distales para

medir la longitud de regeneración.

Separe los DRG junto con las raíces nerviosas y el nervio ciático, con cuidado con microtijeras y micropinzas bajo el microscopio de disección.

Luego, transfiera el nervio ciático directamente en PFA al 4% durante la noche a cuatro grados centígrados. Para obtener imágenes y medir los axones sensoriales marcados con fluorescencia bajo el microscopio de disección, retire el tejido y la membrana adheridos al nervio ciático fijo con microtijeras y microfórceps, con cuidado. Luego, lave el nervio con PBS tres veces.

A continuación, coloque el nervio ciático en un tobogán y manténgalo recto. Agregue 80 microlitros de solución antidecoloración alrededor del nervio, luego coloque un cubreobjetos sobre él. Aplana todo el tejido montado con presión.

Después, coloque el tejido aplanado bajo el microscopio epifluorescente invertido, equipado con un accesorio para la adquisición de mosaicos y el procesamiento de imágenes. Al medir la longitud de los axones regenerados, rastree todos los axones identificables marcados con fluorescencia en el nervio ciático desde el sitio de aplastamiento hasta los extremos de los axones distales.