Name: La cultura de la motora primaria y las neuronas sensoriales en los medios de comunicación definidas en Electrospun poli-L-láctico andamios nanofibras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: Aprende a cultivar neuronas motoras y sensoriales primarias de rata sobre andamios de nanofibras electrohiladas de poli-L-láctico. Este método permite estudiar la regeneración nerviosa y la morfología neuronal in vitro con mayor fidelidad fisiológica.

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NIH K08 EB003996

1. Poli-L-láctico (PLLA) Spinning Solución <ol><li> Disolver 0,4 g PLLA en 9 ml de cloroformo, agitando a fuego lento. </li><li> Añadir 1 ml de dimetilformamida a la solución, con lo que la concentración final de la solución al 4% PLLA (w / v) en cloroformo: DMF 9:1 (v / v). </li><li> Ponga la solución en una jeringa de vidrio o polipropileno, con una punta de metal 23ga contundente. </li></ol> 2. Spinning Preparación del substrato 1 <ol><li> Hacer una solución al 8% (w / v) de 85:15 PLGA (poli-láctico-co-glicólico) en cloroformo, agitando a fuego lento. </li><li> Capa limpia cubierta de vidrio se desliza en PLGA cubriendo la superficie de cada hoja de la cubierta con la solución de PLGA. Deje que el PLGA para secar a una capa delgada (aprox. 30 min). </li></ol> 3. Electrospinning 2 <ol><li> Asegure la cubierta de vidrio recubierta PLGA se desliza al colector con una cinta de carbón conductor. Para las fibras alineadas, el colector es una rueda con motor. Para las fibras de azar, el colector es una placa estacionaria. </li><li> Coloque la jeringa en la bomba con la punta de 20 cm de la rueda del colector. Conjunto de la bomba de aproximadamente 2 ml / hora y si se utiliza una rueda, ajustar el motor a 300-400 RPM. Si es posible, aplicar un sesgo -2 kV DC para el colector y 15 kV hasta la punta de metal. Ante la falta de acceso a una fuente de alimentación bipolar, baja del colector. </li><li> Las fibras se chorro de la punta de la jeringa y se acumulan en la rueda giratoria. Continúe girando hasta que la densidad deseada de las fibras se obtiene. Pase la punta de metal con una toalla de papel colocada en una barra no conductora periódicamente para evitar la obstrucción en la punta. </li></ol> 4. Moating 1 <ol><li> Girar a continuación, 'foso' las muestras electrospun pipeteando una línea de PLGA en todo el perímetro de la hoja de la cubierta. Deje que el PLGA que se seque. Esto mantendrá la alineación de las fibras durante el cultivo. </li></ol> 5. Proteína de revestimiento <ol><li> Electrospun fibras y los controles de vidrio debe ser recubierto en proteínas antes de cultivo celular. Cubrir los sustratos en una solución de proteínas, por lo menos una hora y luego aspirar el exceso de solución y seguir aspirando hasta que los sustratos están secos. Posibles soluciones de proteínas son: PLL (poli-L-lisina) (100 mg / mL), laminina (25 mg / ml) o la fibronectina (50 mg / mL). Si PLL se utiliza, los sustratos deben ser enjuagados con agua estéril y seca dos veces después de la capa inicial. </li></ol> 6. Obtener embriones de rata E15 3 * Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio aprobado por la Universidad de Michigan Comité de Uso y Cuidado de Animales. <ol><li> Preparación: Compruebe si el animal está embarazada. Descongele los 3 ml de tripsina, 3 ml de FBS y calentar un biberón de L15. Fuego pulir una pipeta Pasteur. Desinfectar todos los instrumentos quirúrgicos en el 70% de etanol durante 30 min. </li><li> Preparar y calentar el medio de placas (ver Tabla 1). </li><li> Eutanasia: Realizar una inyección IP de ketamina / xilazina. Espere 10-15 minutos y comprobar por falta de la córnea y el pedal de reflejos de retirada. Una vez que los reflejos están ausentes, realice una inyección de pentobarbital IC (FatalPlus). </li><li> La tienda de la piel del abdomen. Corte a través de la piel y las capas musculares para exponer la cavidad abdominal. Localizar el útero y separarlo en el cuello del útero y los ovarios. </li><li> La toma de embriones del útero con una tijera y colocarlos inmediatamente en caliente L15. (Todos los siguientes procedimientos se realizan bajo un microscopio de disección y los embriones y los cables de disección debe ser sumergido en agua tibia L15 en todo momento.) Decapitar a los embriones por el cierre de pinzas alrededor de la barbilla y debajo del hueso occipital del cráneo. </li></ol> 7. Disección de 3 <ol><li> Coloque el embrión de un lado. Proteger la médula espinal con un juego de pinzas, mientras que con el otro despojarnos de las extremidades y los órganos abdominales. </li><li> A su vez el embrión y mantenerlo fijo con un juego de pinzas. Recorte a lo largo del embrión, desde el cuello hasta la cola, hasta que toda la médula está expuesto. </li><li> Sujete el extremo del cable con cuidado y tire de ella sobre sí misma hacia la cola para retirar. El cable se tire libre con membrana y ganglios de la raíz dorsal (GRD) adjunto. </li><li> Si DRG explante o cultura disociada neurona sensorial se va a realizar, cortar la DRG de la médula y la transferencia a un plato fresco de tibia L15. <ol><li> Por DRG explante cultura, con el paso 10.2 </li><li> Para el cultivo disociado de neuronas sensoriales, vaya al paso 9 </li><li> Para el motor cultura neurona, el DRG se eliminará con la membrana en el paso 7.5 </li></ol></li><li> Quitar la membrana de la médula espinal, sujetándola en el extremo superior de la médula y el pelado hacia abajo, similar a la eliminación de una media de largo. Repita este procedimiento para todos los embriones y luego cortar los cables en pequeños (2-3 mm) piezas. </li></ol><pclass de las neuronas motoras procesamiento>5,6,7 <ol><li> Vierta los cables cortados y L15 en una forma cónica y giran a 1000 rpm durante 2-3 minutos para que sedimenten las piezas. </li><li> Retirar el sobrenadante y agregar 3 ml de tripsina a los cables de pellets. Incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Añadir 3 ml de FBS cónica y giran a 1000 rpm durante 2-3 min para volver a pellet. </li><li> Retirar el sobrenadante y la capa de un incendio pulido pipeta Pasteur con FBS. </li><li> Añadir una pipeta Pasteur, lleno de L15 a la cónica y luego se tritura suavemente hasta que la solución es homogénea sin grumos visibles. Evitar las burbujas. </li><li> Prepare una solución de 9% de Optiprep en L15. Preparar un tubo con 3 ml de la solución Optiprep por cada dos embriones (si hay un número impar de embriones, redondear). </li><li> Caída de la solución homogeneizada en la solución Optiprep, dividiéndola en partes iguales entre todos los tubos. Girar los tubos a 2000 rpm durante 15 minutos. </li><li> Recoger cuidadosamente los 2 ml de cada tubo y la piscina en un Erlenmeyer de 50 ml. Llene el cono con L15 y giran a 1000 rpm durante 5 minutos para enjuagar las células de Optiprep. </li><li> Retirar el sobrenadante y resuspender las células en una pequeña cantidad de medios de chapado (250 a 500 l). Contar las células con azul de tripan exclusión para identificar las células vivas. Vaya al paso 10.1 </li></ol> 9. Neurona sensorial (SN) de elaboración 7 <ol><li> Vierta el DRG eliminado de la médula espinal y L15 en un tubo cónico y giran a 1000 RPM durante 2-3 min para precipitar las piezas. </li><li> Retirar el sobrenadante y agregar 3 ml de tripsina a la DRG granulado. Incubar en un baño de agua 37 ° C durante 10 min. </li><li> Añadir 3 ml de FBS cónica y giran a 1000 rpm durante 2-3 min para volver a pellet. </li><li> Retirar el sobrenadante y la capa de un incendio pulido pipeta Pasteur con FBS. </li><li> Añadir una pipeta Pasteur, lleno de L15 a la cónica y luego se tritura suavemente hasta que la solución es homogénea sin grumos visibles. Evitar las burbujas. </li><li> Girar el homogenado a 1000 rpm durante 5 min. Retirar el sobrenadante y resuspender las células en una pequeña cantidad de medios de comunicación placas SN (250-500 l). Contar las células con azul de tripan exclusión para identificar las células vivas. Continúe con el paso 10.1 </li></ol> 10. Revestimiento y Cultura <ol><li> Para disociar SN o la cultura MN: <ol><li> Cubrir los sustratos con unas gotas de los medios de comunicación a continuación, agregar un volumen apropiado de la suspensión celular. Las células disociadas se sembraron a una densidad baja (25-50 células / mm 2). Permitir que las células se adhieran por lo menos una hora antes de la inundación de los pozos con los medios de comunicación. </li></ol></li><li> Por DRG explante cultura: <ol><li> Cubrir los sustratos con unas gotas de los medios de comunicación a continuación, añadir DRG a los medios de comunicación. Organizar los GRD para que se distribuyen uniformemente a través del substrato (aproximadamente 4 DRG caben en una hoja de 22x22 mm cubierta). Deje que el GRD que se adhieran durante al menos 4 horas antes de la inundación de los pozos con los medios de comunicación. </li></ol></li><li> Culturas se puede mantener durante un máximo de 4 días sin cambiar los medios de comunicación. Durante más tiempo las culturas, la mitad de los cambios medios de comunicación se debe hacer con los medios de alimentación. Alimentar a los medios de comunicación es la misma composición que los medios de comunicación placas menos la L-glutamina. </li></ol> 11. Inmunocitoquímica 1,5,8 <ol><li> La fijación de las células: los medios de comunicación Aspirar y reemplazar con agua tibia 4% PFA (paraformaldehído) durante 30 minutos. A continuación, realizar 3 veces 5 min lavados con PBS 1x. </li><li> Bloqueo / permeabilización: Prepare bloque / perm solución (1,25% de suero albúmina bovina en PBS 1X, un 0,05% Triton X-100 y el 2,0% de suero normal de cabra). Aspirar PBS y aplicar bloque / permanente solución a las muestras durante 30 minutos. A continuación, realice 1X 5 min lavados con PBS 1x. </li><li> Anticuerpo primario: Preparar la solución de anticuerpo primario de trabajo (10% de suero normal de cabra, un 1,25% de albúmina sérica bovina, el 0,1% de azida Na, 0,05% de Triton X-100 y 10 ml con 1x PBS). Añadir la cantidad apropiada de anticuerpo primario (ver Tabla 2). Línea de varios platos con parafilm. Coloque un cordón de 200μl de solución de anticuerpos primarios en la parafina para cada sustrato. Invertir los sustratos, flotando a la par de la celda hacia abajo en la solución de anticuerpo primario de trabajo durante la noche (si la habitación tiene aire acondicionado o en seco sobre todo, un pedazo de papel saturado de agua se pueden agregar a una esquina del plato para evitar la evaporación de la solución de trabajo) . </li><li> Anticuerpo secundario: Retire los sustratos de la primaria (la solución de trabajo pueden ser recogidos, almacenados a 4 ° C y reutilizar) y llevar a cabo 2 veces 5 min lavados con PBS 1x. Aplicar 200 l de anticuerpos secundario diluido 1:200 en PBS (también se invierte en un plato forrado parafina) durante 4 horas. </li><li> Eliminar de secundaria a continuación, realizar 2 veces 5 min lavados con PBS 1x. Soportes de montaje en láminas de oro con prolongar la DAPI u otro contador nuclear adecuada mancha. </li></ol> 12. Los resultados representativos: La morfología típica de alineado y El azarfibras ectrospun se muestra en la Figura 1. Por lo general obtener la pureza de la MN&gt; 90% 7,8 neuronas con este protocolo y hemos mantenido DRG culturas durante todo el tiempo como una semana sin ningún tipo de crecimiento de fibroblastos significativo. La figura 2 muestra la apariencia típica de MN en fibras de vidrio y después de 24 horas de la cultura y la inmunotinción. DRG immunostained cultivadas durante tres días en fibras de vidrio y se muestra en la Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Alineación de la fibra es manipulado por la elección de los colectores. A.) Alineados fibras hiladas en un colector de rueda giratoria y B.) hilar fibras al azar en un colector de placa estacionaria. Las barras de escala = 20 micras. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Representante neuronas motoras teñidas Tuj1 (verde) y DAPI (azul) después de 24 horas de la cultura en A. recubierto PLL) fibras y B) de cristal. Las barras de escala = 20 micras. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Manchada Representante DRG para neurofilamentos (verde) después de 3 días de cultivo en el PLL recubiertas A.) de vidrio y B) las fibras. Las barras de escala = 200 micras. <table border="1"><tbody><tr><td> Solución de reserva: </td><td> MN medios de comunicación: </td><td> DRG / SN medios de comunicación: </td></tr><tr><td> 10 mg mL -1 albúmina </td><td> 12,5 l </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 mg mL -1 apo-transferrina </td><td> 50 l </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> 50 mg mL -1 β-estradiol </td><td> 2,7 l </td><td> 2,2 l </td></tr><tr><td> 0,1 mg mL -1 biotina </td><td> 50 l </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 mg mL -1 catalasa </td><td> L 8 </td><td> - </td></tr><tr><td> 15 mg mL -1 D-galactosa </td><td> 50 l </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 mg mL -1 de hidrocortisona </td><td> 3,7 l </td><td> 2,9 l </td></tr><tr><td> 0,63 mg mL -1 de progesterona </td><td> 0,5 l </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 mg mL -1 putrescina </td><td> 50 l </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 mg mL -1 selenio </td><td> 3,4 l </td><td> 4,1 l </td></tr><tr><td> 2,5 mg mL -1 superóxido dismutasa </td><td> 50 l </td><td> - </td></tr><tr><td> * 500 ng ml -1 nervio del factor de crecimiento </td><td> - </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> * 100X PSN </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> * B27 </td><td> 1 mL </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> * 2 mM L-glutamina </td><td> 35 l </td><td> 35 l </td></tr><tr><td> * Neurobasal </td><td> a 50 ml </td><td> a 50 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Añadir asterisco (*) los componentes de los medios de comunicación justo antes del uso. El resto de componentes se pueden preparar como una solución de reserva y se mantiene a -20 ° C hasta el momento de 6,7. <table border="1"><tbody><tr><td> Primaria (concentración) </td><td> Las neuronas: </td><td> Glia: </td><td> Fibroblastos: </td></tr><tr><td> anti-β-tubulina (Tuj1) (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> anti-neurofilamentos (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> anti-S-100 (1:250) </td><td> X </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td></tr><tr><td> anti-p75 NGFR (1:500) </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td><td> X </td></tr></tbody></table> Tabla 2. La selección de anticuerpo primario depende de los objetivos del investigador. Los anteriores son varios anticuerpos y las concentraciones que se han utilizado con éxito en nuestro laboratorio. S-100 es especialmente útil para identificar las células de Schwann y / o detectar la contaminación fibroblastos, pero tenga en cuenta que se debe utilizar en combinación con NGFR p75 para distinguir entre células gliales y fibroblasts4. También hemos notado que NGFR p75 manchas neuritas muy ligeramente, mientras que neurofilamentos o Tuj1 son excelentes opciones si el objetivo es visualizar neuritas individual. </pclass>

<ol><li>Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+electrospun+PLLA+nanofiber+scaffolds+compatible+with+serum-free+growth+of+primary+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons.</a> Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).</li>
<li>Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+nanofiber+morphologies+using+modulated+electrospinning+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mat.+Res.+Soc.+Symp.+Proc%22%5BJournal%5D)">Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications.</a> Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. Chapter 19 (1998).</li>
<li>Kameda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+glial+progenitor+markers+p75NTR+and+S100+protein+in+the+developing+mouse+parathyroid+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland.</a> Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).</li>
<li>Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+electrospun+nanofibers+specify+the+direction+of+dorsal+root+ganglia+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).</li>
<li>Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-I+prevents+glutamate-induced+motor+neuron+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death.</a> Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).</li>
<li>Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-I+prevents+apoptosis+in+neurons+after+nerve+growth+factor+withdrawal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal.</a> J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).</li>
<li>Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+neuritogenesis+and+maturation+of+primary+spinal+motor+neurons+in+response+to+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers.</a> Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).</li>
<li>Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+parameter+study+for+ultra-fine+fiber+fabrication+via+electrospinning+process%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process.</a> Polymer. 46, 6128-6134 (2005).</li>
<li>Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+highly+aligned+electrospun+poly-L-lactic+acid+fibers+for+nerve+regeneration+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications.</a> J. Neural Eng. 6, (2009).</li>
</ol>

Este protocolo tiene varios pasos críticos. La primera consiste en la correcta producción de los sustratos de fibra electrospun. En medios líquidos, las fibras de PLLA, el cine y el foso PLGA PLGA se separará de la hoja de la cubierta de vidrio como una sola unidad. Si el PLGA se omite, las fibras de PLLA no seguirá siendo una hoja plana - que se acurrucaba en una maraña inutilizable. Así, la película de PLGA se incluye como un sustrato adecuado para mantener la alineación de la fibra durante el cultivo. El foso se añade después de girar tanto para garantizar que las fibras estén bien fijados a la película de PLGA y añadir rigidez estructural de la película. El foso que también sirve como un mango útil cuando los sustratos son manipulados durante la fijación, tinción y montaje. La trituración es el segundo paso crítico. Todo esfuerzo debe hacerse para evitar la formación de burbujas. Además, hemos obtenido un rendimiento mucho mayor cuando una pipeta pulida al fuego se utiliza para este paso. Para pulir el fuego, la luz de un mechero Bunsen y adjuntar una bombilla en la pipeta. Pase la punta de la pipeta rápidamente a través de la llama de 3.2 veces, mientras que continuamente apretar y soltar la bombilla - el flujo de aire a través de la pipeta le ayudará a evitar que la punta no cierran correctamente. Examine la punta de la pipeta para asegurarse el agujero sigue abierto y que los bordes ligeramente redondeados aparecen antes de su uso. Electrospinning es un proceso muy versátil; los parámetros electrospinning se pueden modificar para producir fibras con una variedad de morfologías. Tan et al. (2005) los detalles de un estudio sistemático de los parámetros que afectan el diámetro de las fibras de PLLA electrospun. Wang et al. (2009) presenta un estudio detallado de los parámetros que influyen en la alineación de las fibras de PLLA electrospun.

<table><tbody><tr><td>PLLA</td><td>Boehringer Ingeheim</td><td>Resomer L210</td><td></td></tr><tr><td>PLGA 85:15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43471</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2289</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td>Akorn Inc</td><td>AK8227</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC 23009-0010</td><td></td></tr><tr><td>Galactosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556</td><td></td></tr><tr><td>Pútrescina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selenio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E 1132</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>SOD (superóxido dismutasa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4636</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PSN</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1680149</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1689149</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>2011</td><td></td></tr><tr><td>PLL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F 4759</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TuJ1</td><td>BD Biosciences</td><td>556321</td><td></td></tr><tr><td>Anti-neurofilamento</td><td>EMD Millipore</td><td>AB1987</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NGFR p75</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3908</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de carbono</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13073-1</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold +DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

la cultura de la motora primaria y las neuronas sensoriales en los medios de comunicación definidas en electrospun poli-l-láctico andamios nanofibras

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Electrospinning es una técnica para la producción de micro-fibras de escala nanométrica. Las fibras pueden ser electrospun con distintos grados de alineación, de muy bien alineados para completamente al azar. Además, las fibras se pueden girar de una variedad de materiales, incluyendo polímeros biodegradables tales como poli-L-láctico (PLLA). Estas características hacen que las fibras electrospun adecuado para una variedad de aplicaciones de andamios en ingeniería de tejidos. Nuestra atención se centra en el uso de fibras electrospun alineados para la regeneración nerviosa. Hemos demostrado previamente que las fibras alineadas electrospun PLLA directa el resultado de dos neuronas sensoriales primarias y el motor in vitro. Sostenemos que el uso de un sistema de células de cultivo primario es fundamental en la evaluación de los biomateriales a las neuronas modelo real en vivo tanto como sea posible. A continuación, describimos las técnicas utilizadas en nuestro laboratorio para electrospin andamios fibrosa y la cultura dorsal explantes de ganglios de la raíz, así como disociada neuronas sensoriales y motoras, en los andamios electrospun. Sin embargo, el electrospinning y / o técnicas de cultivo se presentan aquí son fácilmente adaptables para su uso en otras aplicaciones.

Alineados fibras electrospun dirigir el crecimiento de las neuronas in vitro y son un componente potencial de andamios la regeneración nerviosa. Se describe un procedimiento para la preparación de sustratos electrospun fibra y el cultivo libre de suero de rata principal E15 sensorial (GRD) y las neuronas motoras. La visualización de las neuronas por inmunocitoquímica también se incluye.

La cultura de la motora primaria y las neuronas sensoriales en los medios de comunicación definidas en Electrospun poli-L-láctico andamios nanofibras

El electrohilado es una técnica para producir fibras a escala micro y nanométrica. Las fibras pueden electrohilarse con diversos grados de alineación, desde fibras altamente alineadas...

Las fibras de electros bun alineadas dirigen el crecimiento de neuronas in vitro y son un componente potencial de andamios para la regeneración nerviosa. Aquí, se generan andamios de fibras de electros BUN y se cultivan neuronas sensoriales y motoras primarias de rata sobre ellos. Primero, los andamios fibrosos se electrohilan sobre laminillas de vidrio.A continuación, se obtienen neuronas primarias de ratas de día embrionario 15 y se cultivan sobre andamios de fibras electrohiladas. Se permite que las neuronas se adhieran y crezcan, luego se fijan y tiñen mediante técnicas de inmuno citoquímica. Los resultados de imágenes revelan cambios en la morfología de las neuronas cultivadas sobre fibras electrohiladas, lo que indica que la nano topografía de las fibras electrohiladas puede dirigir el crecimiento de los neuritos.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el uso de líneas celulares transformadas, es que las neuronas primarias in vitro imitan más de cerca el comportamiento de las neuronas in vivo que las células transformadas. Estas técnicas ofrecen a los usuarios la posibilidad de utilizar fibras electrofun con otros tipos celulares. Alternativamente, los usuarios podrían desear emplear neuronas motoras y sensoriales cultivadas para otros fines investigativos.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la electrospun es un proceso delicado, lo cual explicamos con mayor detalle en nuestro artículo en video adjunto. Para preparar sustratos de fibra electrohilada, comience por preparar una solución al 8% de ácido poliláctico co-glicólico 85 a 15 o PLGA en cloroformo y una solución al 4% de poli-L-lactida o PLLA en cloroformo, agitando con calor bajo. A continuación, recubra láminas de vidrio limpias con PLGA cubriendo completamente la superficie de cada lámina con la solución de PLGA. Deje secar el PLGA hasta formar una película delgada, lo cual toma aproximadamente 30 minutos.Una vez que el PLGA esté seco, utilice cinta de carbono conductor para fijar un cubreobjetos recubierto de PLGA a una rueda accionada por motor para generar fibras alineadas o a una placa estacionaria para fibras aleatorias. Coloque una jeringa que contenga la solución de PLLA al 4 % en una bomba con una punta, posicionada a 20 centímetros del colector.Configure la bomba a aproximadamente 0,22 mililitros por hora. Ajuste el motor de la rueda a entre 300 y 400 rotaciones por minuto. Aplique un sesgo de corriente continua de menos dos kilovoltios al colector y de más 15 kilovoltios a la placa conductora, que está en contacto con la punta metálica.En ausencia de acceso a una tierra de fuente de alimentación bipolar, el colector inicia la bomba de jeringa, las fibras saldrán del extremo de la jeringa y se acumularán en la rueda giratoria. Continúe girando hasta obtener la densidad deseada de fibras; para evitar el obstrucción del extremo metálico, límpielo periódicamente con una toalla de papel sujeta a una varilla no conductora, siguiendo la línea del pipeteador giratorio de PLGA alrededor del perímetro del cubreobjetos. Básicamente, se coloca un foso alrededor de los electros.Las muestras en forma de embudo permiten que el PLGA se seque. Esto mantendrá el alineamiento de las fibras durante el cultivo. Las fibras electrohiladas y los controles de vidrio deben recubrirse con proteína antes del cultivo celular.Para hacer esto, cubra los sustratos con poliol, lisina, laminina o fibronectina durante al menos una hora. Luego aspire la solución excesiva hasta que los sustratos estén secos. Si se utiliza lisina de poliol, el sustrato debe enjuagarse con agua estéril y secarse dos veces tras el recubrimiento inicial.Una vez que estén secos, coloque los sustratos en placas de cultivo celular de seis pocillos para preparar las células cultivadas que se desarrollarán sobre las fibras de electros bun. Obtenga embriones E 15 de una rata preñada sacrificada. Comience por esterilizar el área con etanol al 70 % y luego levante la piel del abdomen formando una tienda.Corte a través de las capas de piel y músculo para exponer la cavidad abdominal. Localice el útero y desátelo en el cuello uterino y los ovarios. Transfiera el útero a un recipiente estéril.Luego retire los embriones del útero con tijeras y colóquelos inmediatamente en L-15 tibio. Después de decapitar los embriones, coloque un embrión de lado protegiendo la médula espinal con un par de pinzas. Utilice el otro par para retirar las extremidades y los órganos abdominales.A continuación, gire el embrión y sosténgalo firmemente con un par de pinzas. Corte a lo largo del embrión desde el cuello hasta la cola hasta que se exponga toda la médula espinal. Sujete cuidadosamente el extremo de la médula espinal y luego tírelo sobre sí mismo hacia la cola.Para eliminarlo, el cordón se desprenderá libremente con la membrana y los ganglios de la raíz dorsal adheridos. Si se va a realizar un cultivo de ganglios de la raíz dorsal x explante o de neuronas sensoriales disociadas, corte los ganglios de la raíz dorsal del cordón y transfiéralos a una nueva placa con L-15 tibia. Para el cultivo de neuronas motoras.Sujete la membrana de la médula espinal en el extremo anterior de la cuerda y despréndala hacia abajo. De forma similar a como se quita un calcetín largo, repita este proceso para todos los embriones y luego, utilizando pinzas, corte las cuerdas en trozos pequeños para obtener cultivos de neuronas motoras.Vierta las médulas espinales picadas y el L-15 en un tubo cónico y centrifúguelo a 180 ×g durante dos o tres minutos. Para obtener el sedimento de los fragmentos, retire el sobrenadante y agregue tres mililitros de tripsina a las médulas sedimentadas. Coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius e incúbelo durante 20 minutos.Después de la incubación, agregue tres mililitros de suero bovino fetal al tubo cónico. Luego, centrifugue a 180 ×g durante dos o tres minutos para repelerlo. Mientras tanto, pase una pipeta de pasta COTA por la llama y pólala con suero bovino fetal aspirando el suero bovino fetal dentro de la pipeta y luego expulsándolo.Esto evita que fragmentos de tejido se adhieran al vidrio durante la trituración. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante. Luego, agregue una pipeta completa de pasta de L-15 al tubo cónico y triture suavemente utilizando la pipeta recubierta con SFB hasta que la solución sea homogénea y no se observen grumos.Evite burbujas. Prepare un tubo con tres mililitros de 9% opre en L 15 por cada dos embriones. Si hay un número impar de embriones, agregue una gota.La solución homogeneizada encima de la solución de OptiPrep, dividiendo el homogenato uniformemente entre todos los tubos. El homogenato formará una capa turbia visible encima de la solución de OptiPrep. Centrifugar los tubos a 700 × g durante 15 minutos.Recopile cuidadosamente los dos mililitros superiores de cada tubo y transfiera a un tubo cónico de 50 mililitros. Llene el tubo cónico con L-15 y centrifugue a 180 ×g durante cinco minutos para lavar las células de opre. Retire el sobrenadante.El precipitado rara vez es visible a simple vista. En esta etapa, Reese, suspenda las células en una pequeña cantidad de medio de siembra. Cuente las células utilizando la exclusión con azul de tripano para identificar las células viables.Las células ya están listas para su siembra. Se espera obtener cultivos de neuronas sensoriales con una pureza superior al 90 %. Comience vertiendo los ganglios de la raíz dorsal extraídos de las médulas espinales y del L 15 en un tubo cónico.Centrifugar a 180 ×g durante dos o tres minutos para formar el pellet de los fragmentos tras la centrifugación. Verter el sobrenadante y añadir tres mililitros de trips al DRG en pellet; incubar en un baño de agua a 37 °C. Después de 10 minutos, retirar el tubo del baño de agua y añadir tres mililitros de SFB al tubo; centrifugar a 180 ×g durante dos o tres minutos para resuspender el pellet.Mientras tanto, revista con FBS una pipeta de pasta pulida al fuego. Como antes, use la pipeta recubierta con FBS para agregar una pipeta completa de L-15 al sedimento y tri-ture suavemente hasta que la solución sea homogénea y no se observen grumos. Evite las burbujas después de centrifugar el homogenado a 180 ×g durante cinco minutos.Elimine el sobrenadante y re suspenda las células en una pequeña cantidad de medio de cultivo para neuronas sensoriales. Cuente las células utilizando la exclusión con azul de tripano para identificar las células viables. Las células ya están listas para sembrarse en cultivo de neuronas sensoriales o motoras.Comience cubriendo los sustratos de fibras electrohiladas recubiertos con proteína con unas gotas de medio. Luego agregue un volumen adecuado de suspensión celular. Las células disociadas deben sembrarse a baja densidad.Deje que las células se adhieran durante al menos una hora en el incubador antes de llenar los pocillos con medio y devolverlos al incubador para su cultivo. Las berenjenas de ganglios de la raíz dorsal cubren los sustratos de fibras electrohiladas recubiertas de proteína con unas gotas de medio. Luego agregue ganglios de la raíz dorsal al medio.Coloque los ganglios de la raíz dorsal de manera que queden distribuidos uniformemente sobre el sustrato. Aproximadamente cuatro ganglios de la raíz dorsal caben en un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros. Coloque los cultivos de ganglios de la raíz dorsal en el incubador a 37 grados Celsius y déjelos adherirse durante al menos cuatro horas tras la incubación.Inunde los pocillos con medio y devuélvalos al incubador. Los cultivos pueden mantenerse hasta cuatro días sin cambio de medio. Para cultivos más prolongados, se deben realizar cambios parciales del medio con medio de alimentación.El medio de cultivo tiene la misma composición que el medio de siembra, excepto por la ausencia de L-glutamina. Una vez que las células hayan alcanzado el punto temporal deseado, se puede realizar la inmunocitoquímica según las instrucciones del protocolo escrito adjunto. Esta imagen de MEB ilustra la morfología típica de las fibras electrohiladas alineadas y aleatorias.El alineamiento de las fibras se manipula mediante la elección del colector. Tenga en cuenta que las fibras hiladas sobre un colector giratorio presentan un alineamiento uniforme. En contraste, las fibras hiladas sobre un colector estacionario tienen una morfología aleatoria.Estas imágenes muestran la tinción de neuronas motoras para beta tubulina, mostrada en verde, y la tinción nuclear con DPI en azul. Después de 24 horas de cultivo sobre fibras recubiertas con PLL y sobre vidrio en fibras, las neuronas motoras generalmente presentan pocos prolongaciones que se proyectan desde el cuerpo celular paralelamente a la dirección de alineación de las fibras, que en esta imagen es de izquierda a derecha. Las prolongaciones principales de las células cultivadas sobre fibras son mucho más largas que las prolongaciones principales de las células cultivadas sobre vidrio en tiempos equivalentes.Los puntos en las neuronas motoras de vidrio suelen tener más prolongaciones a las 24 horas, las cuales se extienden radialmente desde el cuerpo celular. Las neuronas cultivadas sobre fibras. El proceso principal también es más corto en vidrio que en las fibras en estas imágenes.Los ganglios de la raíz dorsal se tiñen para neurofilamento, mostrado en verde. Después de tres días de cultivo sobre vidrio recubierto con PLL y fibras, las neuronas emanan radialmente desde el ganglio de la raíz dorsal. También hay una superposición significativa de neuritas adyacentes sobre las fibras.Las neuritas también emanan radialmente desde el ganglio. Sin embargo, posteriormente giran y siguen la dirección de las fibras alineadas. Hay significativamente menos superposición de neuritas adyacentes una vez que se dominan estos procedimientos.La electrospun puede realizarse en aproximadamente 30 minutos, y los neuronas motoras y sensitivas pueden obtenerse en aproximadamente dos horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar una técnica estéril. El uso de una pipeta pulida con fuego en el paso de iteración es necesario para maximizar la supervivencia neuronal.Además, es importante incubar la molécula de adhesión y las fibras electrohiladas durante el tiempo adecuado. Por ejemplo, si las fibras se recubren con polilisina durante menos de una hora, el recubrimiento será insuficiente para permitir la adhesión celular. Sin embargo, si se deja la polilisina durante demasiado tiempo, como durante la noche, las fibras pueden degradarse.También es importante recordar que la mayoría de los microscopios no permitirán la visualización de neuronas sobre las fibras durante el cultivo. Esto se debe a que las fibras y los procesos neuronales son muy similares en apariencia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar cultivos primarios de neuronas motoras y sensoriales de ratas de día embrionario 15 sobre sustratos de fibras electrohiladas.No olvide que trabajar con altos voltajes puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones adecuadas para aislar al operador del equipo eléctrico de hilado.

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Neurociencia

Andamios electrospun puede ser procesado post-producción para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Aquí se describen los métodos para hacer girar los andamios complejos (por hilado consecutivos), para la fabricación de andamios más gruesas (por el multi-capas usando calor o recocido de vapor), para lograr la esterilidad (la producción aséptica o esterilización de la post-producción) y para la consecución de adecuadas propiedades biomecánicas.

Postproducción de procesamiento de las Fibras electrospun de Ingeniería de Tejidos

Este video muestra la creación de un modelo de tejido neuronal polarizado en 3D utilizando andamios de seda-colágeno. Detalla el proceso de siembra de células neuronales en andamios de seda porosa, la incubación para la unión celular, la incrustación del andamio con colágeno y subraya la importancia de la matriz de colágeno de soporte en la formación de un modelo de tejido neuronal polarizado en 3D.

Desarrollo de un modelo 3D de tejido neural polarizado basado en seda y colágeno

Este protocolo combina electrospinning y microesferas para desarrollar andamios de ingeniería tisular para dirigir neuronas. El factor de crecimiento nervioso se encapsuló dentro de microesferas de PLGA y se electrohiló en andamios fibrosos de ácido hialurónico (HA).  La bioactividad proteica se probó sembrando los andamios con ganglios primarios de la raíz dorsal del pollito y cultivando durante 4-6 días.

Factor de Crecimiento de electrospinning Liberar microesferas en Fibrosa andamios

Se informó de síntesis y fabricación de fibras electrohiladas largos que abarcan un área de depósito más grande a través de un colector de nuevo diseño de un nuevo polímero biodegradable llamado poli (glicerol-dodecanoato) (PGD). Las fibras fueron capaces de apoyar el crecimiento de células derivadas de células madre pluripotentes de ratón.

Electrospun fibroso Andamios de poli (glicerol-dodecanodioato) de Ingeniería Neural Los tejidos de las células madre embrionarias de ratón

Este artículo describe una gama de configuraciones para sembrar células madre mesenquimales humanas en materiales, en este caso hilos electrohilados, que no cubren la base de las placas de pocillos de cultivo estándar con el fin de maximizar y cuantificar el número de células que se adhieren inicialmente en comparación con la densidad de siembra conocida.

Optimización de unión de las células madre mesenquimales humanas en poli (ε-caprolactona) electrohiladas Hilos

A continuación, presentamos un protocolo para fabricar nanofibras andamios electrospun con organización gradated de fibras y explorar sus aplicaciones en la regulación de la morfología celular / orientación. Gradientes con respecto a las propiedades físicas y químicas de las nanofibras andamios ofrecen una amplia variedad de aplicaciones en el campo biomédico.

Electrospun nanofibras andamios con gradaciones en Organización de fibra

La comprensión de las complejas acciones del cerebro requiere herramientas de investigación avanzadas. Aquí demostramos un novedoso modelo de ingeniería 3D basado en colágeno de seda de tejido neuronal que se asemeja a una arquitectura similar a la del cerebro. El modelo se puede utilizar para estudiar el ensamblaje de redes neuronales, la guía axonal, las interacciones célula-célula y la actividad eléctrica.

Modelo de polarizado Neural tisular basada Silk-colágeno-Engineered 3D

Los avances en las tecnologías de biomateriales permiten el desarrollo de construcciones tridimensionales de tipo multicélula. Hemos desarrollado protocolos de electrospinning para producir tres andamios individuales para cultivar las principales células estructurales de la vía aérea y proporcionar un modelo 3D in vitro de la pared del bronquiolo de la vía aérea.

Adaptación del Proceso Electrohilado para proporcionar tres ambientes únicos para un Tri-capa<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la pared de la vía aérea

Adjunto, presentamos un protocolo para el cultivo 3D de rata células glia derivado del cerebro, incluyendo astrocitos, microglia y oligodendrocitos. Demostramos cultivo celular primario, síntesis de hidrogel desarrolla el ácido hialurónico (HAMA), encapsulación HAMAphoto-polimerización y de la célula y muestra de procesamiento para la proyección de imagen microscópica electrónica de barrido y confocal.

Mejora 3D hidrogel culturas de células Glial primarias para In Vitro modelado de neuroinflamación

Esta metodología tiene como objetivo ilustrar los mecanismos por los cuales las señales de matriz extracelular tales como rigidez del sustrato, composición de proteínas y morfología celular regulan el fenotipo de células Schwann (SC).

Preparación de microambientes de matriz extracelular sintonizable para evaluar la especificación del fenotipo celular Schwann

Aquí, demostramos cómo las células epiteliales cultivadas con fibroblastos en el sistema de dos capas basado en membranas nanofibrosas pueden adherirse y crecer de manera estable en la membrana.

Establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas

Aprende a cultivar neuronas motoras y sensoriales primarias de rata sobre andamios de nanofibras electrohiladas de poli-L-láctico. Este método permite estudiar la regeneración nerviosa y la morfología neuronal in vitro con mayor fidelidad fisiológica.

La cultura de la motora primaria y las neuronas sensoriales en los medios de comunicación definidas en Electrospun poli-L-láctico andamios nanofibras (Video) | JoVE Journal

La cultura de la motora primaria y las neuronas sensoriales en los medios de comunicación definidas en Electrospun poli-L-láctico andamios nanofibras

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