Transducción lentiviral de células progenitoras neurales para la regulación epigenética de la expresión de alfa-sinucleína

Descongele las células progenitoras neurales o NPC almacenadas con un crioprotector en un bloque térmico.

Estas NPC expresan un aumento de alfa-sinucleína, un factor clave en la enfermedad de Parkinson.

Transfiera las células descongeladas a un tubo que contenga medios basales tibios para diluir el crioprotector.

Centrifugar para granular las células, eliminar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en medios neuronales.

Agregue la suspensión celular a una placa multipocillo recubierta de ECM e incube para permitir la adhesión y proliferación celular.

Agregue vectores lentivirales que contengan ARN guía, metiltransferasa Cas9-DNA desactivada y un gen de resistencia a los antibióticos.

Incubar para facilitar la entrada viral, la transcripción inversa del ARN viral, la integración en el genoma del huésped y la expresión transgénica.

El ARN guía dirige dCas9 al gen de la alfa-sinucleína, donde la metilación del ADN mediada por metiltransferasa reduce la expresión de alfa-sinucleína.

Reemplace el medio con medios neuronales que contengan antibióticos para seleccionar células transducidas, mientras que las células no transducidas sufren apoptosis.

Coloque un Cryovial con MD NPC en un bloque de calor a 37 grados Celsius durante dos minutos y transfiera las células descongeladas a un tubo cónico de 15 mililitros con 10 mililitros de DMEM-F12 caliente.

Centrifugar a 300 g durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en dos mililitros de medio N2B2 completo precalentado. Agregue dos mililitros de N2B27 a la suspensión celular y coloque dos mililitros de celdas en cada pocillo de la placa de seis pocillos recubierta de BMM previamente preparada.

Incube las células a 37 grados centígrados con un 5% CO_2 durante la noche. Cuando los NPC MD estén al 70% de confluencia, transducirlos agregando dos microlitros de vectores de ARN guía d-Cas9-DNMT3A de lentivirus y girar suavemente la placa. Después de incubar las células en las mismas condiciones que antes durante 16 horas, reemplace el medio N2B27 48 horas después de la transducción.

Agregue N2B27 con cinco microgramos por mililitro de puromicina