Transducción viral en el útero en un ratón

Tome una mezcla de virus que contenga un gen deseado para la transducción y un tinte de seguimiento en un tampón.

Aspira la mezcla de virus y tinte en un capilar de punta fina.

Tome una rata embarazada anestesiada con una región abdominal afeitada.

Desinfecte la piel con etanol, seguido de una solución de betadina.

Haga una incisión en la línea media para exponer la cavidad abdominal y coloque una película de parafina sobre ella.

Exponga los cuernos uterinos y vierta un tampón sobre ellos para evitar la sequedad.

Tenga en cuenta el orden y la posición de los embriones. Ajuste la posición del embrión dentro del saco uterino para acceder a los sitios de inyección.

Inyecte la mezcla de virus y tinte en la médula espinal y los ventrículos cerebrales.

Garantice una inyección precisa visualizando la distribución del tinte.

Vuelva a colocar los cuernos uterinos en la cavidad abdominal y vierta un poco de tampón.

Sutura la cavidad abdominal, seguida de la piel.

El virus inyectado ingresa a la célula huésped, liberando el gen objetivo y permitiendo su expresión.

Comience cargando una punta capilar personalizada que contenga cuatro veces 10 a las 11 partículas virales del recubrimiento del virus adenoasociado tipo 1 para el objetivo deseado, y etiquetada con tinte Fast Green en un tubo aspirador. Agregue 15 microlitros de las partículas de virus adenoasociadas marcadas en el capilar.

A continuación, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un ratón embriorio anestesiado del día 14.5 y desinfecte la piel. Use pinzas de iris dentadas curvas y tijeras rectas de carburo de tungsteno para hacer una incisión en la piel a lo largo de la línea mediana. Usando pinzas rectas Dumont para agarrar la pared peritoneal, continúe a lo largo de la línea alba con unas tijeras Vannas rectas y coloque un trozo de película de parafina fenestrada sobre la abertura abdominal y use un dispositivo similar a una cuchara para exponer los cuernos uterinos sin dañar los embriones dentro de los cuernos.

Después de aplicar unas gotas de PBS a 37 grados Celsius en los cuernos uterinos, inspeccione los embriones en busca de daños o malformaciones dentro del saco uterino. Gire los embriones con cuidado dentro de sus sacos hasta lograr la posición deseada para cada inyección. Cuando los embriones estén en su lugar, inyecte uno o dos microlitros de la solución de partículas de virus marcada Fast Green en cada embrión.

Después de que se hayan inyectado todos los embriones, vuelva a colocar los cuernos uterinos en la cavidad abdominal y agregue unas gotas de PBS a 37 grados Celsius en el abdomen. Luego use suturas de poliamida de tamaño 6-0 para cerrar la pared peritoneal y suturas de poliamida de tamaño 3-0 y pinzas hemostáticas Halsted's Mosquito para cerrar la piel.