Inyección de células progenitoras neurales fluorescentes en organoides cerebrales humanos para modelado de trasplantes
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 3:40 min • August 29th, 2025
Comience con células progenitoras neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas marcadas con fluorescencia o NPC.
Vuelva a suspender las células en un hidrogel de matriz extracelular para crear una mezcla uniforme de matriz celular.
Incuba la mezcla en hielo.
A continuación, transfiera un organoide cerebral humano a un plato.
Retire el exceso de medios y coloque el plato bajo un microscopio para el procedimiento de inyección.
Dispense la mezcla de matriz celular en un portaobjetos de vidrio estéril preenfriado y aspírelo con una jeringa preenfriada.
Inyecte lentamente la mezcla sobre la superficie del organoide para minimizar la alteración del tejido.
Deje reposar el organoide brevemente, luego agregue medios, transfiera el organoide a una placa de pocillos múltiples e incube.
El hidrogel se solidifica, anclando los NPC en el lugar de la inyección. Realice un seguimiento de los NPC mediante microscopía de fluorescencia.
Con el tiempo, las NPC proliferan y migran a regiones distantes del organoide, donde se diferencian en neuronas inmaduras y maduras.
Esto permite un trasplante celular confiable con una interrupción mínima de los organoides, adecuado para la terapia de células neurales.
Comience retirando la suspensión unicelular de células madre pluripotentes inducidas o células progenitoras neurales derivadas de iPSC, o NPC, del hielo y centrifugándolas a 300 g durante cinco minutos a 4 grados centígrados.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en 3 miligramos por mililitro de matriz de membrana basal solubilizada para obtener un volumen final de dos microlitros por inyección. Vuelva a colocar inmediatamente la suspensión sobre el hielo hasta su uso. Transfiera la jeringa preenfriada del congelador a 20 grados centígrados a un cubo de hielo para su uso posterior.
A continuación, retire la placa del organoide cerebral de la incubadora y transfiera el organoide a un plato de 35 milímetros con una punta de diámetro ancho. Para estabilizar los organoides y facilitar la inyección, retire el medio tanto como sea posible sin dañar el organoide. Coloque el plato de 35 milímetros que contiene el organoide bajo un microscopio de disección para facilitar la inyección.
Una vez que los organoides estén listos para inyectar, vuelva a suspender suavemente las células NPC marcadas con EGFP con una punta de pipeta P20 fría y mueva dos microlitros de estas células a un portaobjetos de vidrio estéril preenfriado. Tome una jeringa de insulina precargada del hielo y extraiga lentamente los 2 microlitros de suspensión celular con el bisel de la aguja hacia abajo. Abra la tapa del plato que contiene el organoide antes de enfocar el microscopio sobre él.
Sostenga el plato con una mano, coloque el bisel de la aguja hacia arriba. Y con la otra mano, inyecte la célula lentamente en la superficie del organoide. Después de inyectar las células, vuelva a colocar la tapa en el plato e incube el organoide inyectado durante uno o dos minutos.
Luego, agregue suavemente 500 microlitros del medio organoide a la placa antes de transferir el organoide a una placa de 24 pocillos con una punta de diámetro ancho. Incube el organoide a 37 grados Celsius y 5 por ciento de dióxido de carbono con un cambio completo de medio cada dos días.
Descripción general
Este artículo describe un método para inyectar células progenitoras neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas marcadas con fluorescencia (NPCs) en organoides cerebrales humanos. La técnica minimiza la alteración del tejido y permite un trasplante celular eficaz, lo cual es fundamental para la terapia con células neurales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología de Células Madre
- Terapia Celular
Antecedentes
- Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) pueden diferenciarse en diversos tipos celulares.
- Las células progenitoras neurales (NPCs) son esenciales para el desarrollo y la reparación del cerebro.
- Los organoides cerebrales humanos sirven como modelos para estudiar el desarrollo cerebral.
- Se necesitan técnicas efectivas de trasplante celular para aplicaciones terapéuticas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para inyectar NPCs en organoides cerebrales.
- Seguir el comportamiento de los NPCs tras la inyección mediante microscopía de fluorescencia.
- Evaluar la viabilidad y la integración de los NPCs dentro del organoide.
Métodos Utilizados
- Preparación de las NPCs a partir de iPSCs y resuspensión en un hidrogel.
- inyección de la mezcla célula-matriz en el organoide utilizando una jeringa previamente enfriada.
- seguimiento de la proliferación y migración de las NPCs dentro del organoide.
- incubación del organoide en condiciones controladas tras la inyección.
Resultados Principales
- Las CNP se integraron con éxito en el organoide con mínima perturbación.
- La microscopía de fluorescencia confirmó la proliferación y migración de las CNP.
- Las CNP inyectadas se diferenciaron en neuronas inmaduras y maduras a lo largo del tiempo.
- El método demostró potencial para aplicaciones en terapia con células neuronales.
Conclusiones
- La técnica de inyección desarrollada es efectiva para el trasplante de células progenitoras neurales.
- Este método puede mejorar la investigación sobre el desarrollo y la reparación cerebral.
- Estudios futuros podrían explorar aplicaciones terapéuticas en enfermedades neurodegenerativas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La modelización del trasplante de células progenitoras neurales en organoides cerebrales humanos proporciona una plataforma reproducible y libre de animales para evaluar la integración y diferenciación celular en contextos de enfermedades del sistema nervioso central. Este enfoque permite una evaluación predictiva de estrategias de terapia celular neural en la etapa preclínica de descubrimiento, apoyando la reducción de riesgos mecanicistas y la continuidad traslacional de carteras de neuroregeneración.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar el comportamiento de las células progenitoras neurales en un modelo cerebral tridimensional relevante para el ser humano.
- Apoya la desactivación mecanicista de riesgos mediante el seguimiento de la proliferación, migración y diferenciación celular tras el trasplante.
- Facilita la validación funcional de dianas para candidatos a terapias celulares del sistema nervioso central.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Establece un protocolo estandarizado y reproducible para la inyección y seguimiento de células neurales en organoides.
- Proporciona resultados cuantitativos mediante microscopía de fluorescencia para el análisis del destino celular y la integración.
- Prepara sistemas de organoides validados para cribados posteriores de compuestos o genéticos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con la modelización relevante para enfermedades de trastornos del sistema nervioso central mediante organoides derivados de humanos.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de enfoques de terapia celular.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la modelización de la integración neural humana ex vivo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica para la terapia celular del SNC, conectando estudios mecanicistas iniciales y modelos traslacionales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre el injerto y la diferenciación de células neuronales en un contexto humano.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles sobre el destino celular y la migración.
- Análisis: Permite la comparación estadística de los resultados del trasplante entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Ofrece una plataforma para evaluar el comportamiento terapéutico de células en organoides relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un sistema escalable, libre de animales y adaptable a diversos programas de terapia celular del SNC.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los mecanismos y la integración de la terapia con células neurales.
- Valor operativo: Estandariza la modelización de trasplantes con mínima alteración del tejido y alta reproducibilidad.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción de candidatos a terapias celulares para el sistema nervioso central al proporcionar datos relevantes para humanos desde una etapa temprana.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de activos de terapia celular dirigidos a trastornos del sistema nervioso central.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células madre, manipulación de organoides y técnicas de microinyección.
- Necesita acceso a microscopía de fluorescencia e infraestructura de incubación controlada.
- Exige estandarización entre equipos para protocolos reproducibles de preparación e inyección celular.
- Adaptable a diversas fuentes de células progenitoras neurales y modelos de organoides.
- Limitado a modelos ex vivo; la traducción in vivo requiere validación adicional.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
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Última actualización: 29 agosto 2026