Separación de las fracciones de membrana interna y externa de bacterias gramnegativas

Comience con la fracción total de la membrana de una bacteria Gram-negativa, incluidas las vesículas de la membrana interna y externa, suspendida en una sacarosa de baja densidad que preserva la integridad estructural.

Para separar las vesículas de membrana, agregue secuencialmente soluciones de sacarosa de alta y media densidad en un tubo de ultracentrífuga.

A continuación, agregue la fracción de membrana y la sacarosa de baja densidad para crear un gradiente de sacarosa discontinuo.

Ultracentrífuga para separar vesículas en función de sus densidades.

Las vesículas de la membrana interna menos densas forman una capa en la parte superior.

Las vesículas de la membrana externa más densas, ricas en lipopolisacáridos y proteínas, forman una banda en la interfaz de las soluciones de sacarosa de densidad media y alta.

Recoja la capa interna de la membrana y deseche la solución de gradiente, dejando una pequeña cantidad.

Luego, recoja la capa de membrana externa.

Agregue un búfer de almacenamiento a cada fracción para estabilizar.

Centrifugar para separar las vesículas y eliminar el sobrenadante.

Vuelva a suspender las vesículas de membrana purificadas, homogeneizarlas y almacenarlas a bajas temper