Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:16 min. • August 29th, 2025
El polifosfato inorgánico (poliP) es un polímero de fosfato lineal involucrado en la virulencia bacteriana y la respuesta al estrés, almacenado como gránulos citoplasmáticos.
Para cuantificar el poliP, tome una placa de pocillos múltiples con concentraciones crecientes de patrones de fosfato inorgánico.
Agregue extracto de poli P bacteriano purificado a un pozo vacío.
Introducir un tampón de reacción que contenga la enzima exopolifosfatasa en cada pocillo e incubar.
La enzima escinde poliP en fosfato inorgánico libre, convirtiéndolo en una forma cuantificable.
Agregue un reactivo de detección que contenga molibdato y ácido ascórbico e incube.
El molibdato reacciona con el fosfato para formar complejos de fosfomolibdato, que son reducidos por el ácido ascórbico en complejos de color azul.
Mida la absorbancia del complejo coloreado. La absorbancia medida corresponde a la intensidad del color azul, que es directamente proporcional a la concentración de fosfato.
Genere la curva estándar y calcule los niveles de fosfato de la muestra, reflejando el contenido original de poliP de la bacteria.
Comience preparando estándares que contengan cero, cinco, 50 o 200 fosfato de potasio micromolar en un pH de 50 milimolares de trichidrato de ocho.
Alícuota de 100 microlitros de cada patrón de fosfato y 100 microlitros de muestras de poliP extraídas en pocillos separados de una placa transparente de 96 pocillos. Prepare una mezcla maestra que contenga, por muestra, 30 microlitros de tampón de reacción 5X ScPPX, 19 microlitros de agua y un microlitro de ScPPX purificado. Agregue 50 microlitros de la mezcla maestra a cada pocillo de la placa de 96 pocillos.
E incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados. El día de la detección, prepare un nuevo material de trabajo de solución de detección mezclando 9,12 mililitros de base de solución de detección con 88 mililitros de ácido ascórbico molar y deje que alcance la temperatura ambiente antes de su uso. Agregue 50 microlitros de solución de detección a cada muestra y estándares en la placa de 96 pocillos.
Para permitir el desarrollo del color, incube la placa a temperatura ambiente durante aproximadamente dos minutos. Utilice un lector de placas para medir la absorbancia a 882 nanómetros y calcule la concentración de fosfato de cada muestra en comparación con la curva estándar de fosfato de potasio. Luego, convierta las concentraciones de fosfato en nanomoles de fosfato derivado de poliP en cada lisado celular y normalice el contenido celular de poliP a proteína celular total, como se describe en el manuscrito.