Un ensayo para la cuantificación de polifosfato inorgánico en bacterias
Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:16 min. • August 29th, 2025
El polifosfato inorgánico (poliP) es un polímero de fosfato lineal involucrado en la virulencia bacteriana y la respuesta al estrés, almacenado como gránulos citoplasmáticos.
Para cuantificar el poliP, tome una placa de pocillos múltiples con concentraciones crecientes de patrones de fosfato inorgánico.
Agregue extracto de poli P bacteriano purificado a un pozo vacío.
Introducir un tampón de reacción que contenga la enzima exopolifosfatasa en cada pocillo e incubar.
La enzima escinde poliP en fosfato inorgánico libre, convirtiéndolo en una forma cuantificable.
Agregue un reactivo de detección que contenga molibdato y ácido ascórbico e incube.
El molibdato reacciona con el fosfato para formar complejos de fosfomolibdato, que son reducidos por el ácido ascórbico en complejos de color azul.
Mida la absorbancia del complejo coloreado. La absorbancia medida corresponde a la intensidad del color azul, que es directamente proporcional a la concentración de fosfato.
Genere la curva estándar y calcule los niveles de fosfato de la muestra, reflejando el contenido original de poliP de la bacteria.
Comience preparando estándares que contengan cero, cinco, 50 o 200 fosfato de potasio micromolar en un pH
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