Ensayo de replicación de Legionella pneumophila en macrófagos pretratados con vesículas de membrana externa

Comience con una placa de pocillos múltiples que contenga macrófagos pretratados expuestos a vesículas de membrana externa bacterianas de Legionella pneumophila, u OMV.

Agregue Legionella pneumophila a una proporción definida de bacterias a células huésped para infectar los macrófagos tratados con OMV.

Durante la incubación, los macrófagos internalizan las bacterias dentro de los fagosomas unidos a la membrana.

El pretratamiento con OMV altera la señalización de los macrófagos, inhibiendo la maduración de los fagosomas.

Esto facilita la formación de una vacuola que contiene Legionella, que protege a las bacterias y permite la replicación intracelular.

Añadir un detergente e incubar para lisar los macrófagos. Esto libera las bacterias intracelulares en el medio.

Raye el lisado diluido en una placa de agar enriquecida con nutrientes.

Durante la incubación, las bacterias crecen y forman colonias visibles.

Cuente las colonias para determinar las unidades formadoras de colonias, o UFC, que representan el número de bacterias viables.

Compare los recuentos de UFC entre macrófagos tratados con OMV y no tratados.

Una UFC más alta en los macrófagos tratados con OMV en comparación con los no tratados indica que los OMV facilitan la supervivencia de Legionella dentro de los macrófagos.

Infectar células THP-1 pretratadas o no tratadas con núcleo de cepa B de L. pneumophila de tipo salvaje o células BMDM murinas con un mutante carente de flagelos de esta cepa sin cambiar el medio de las células.

Agregue bacterias a un MOI de 0.5 que equivale a uno por 10 al quinto L. pneumophila por pocillo. Incubar los cultivos durante 24 y 48 horas respectivamente. Para lisar las células, añadir saponina a una concentración final del 0,1% e incubar las células durante cinco minutos.

Luego raye 50 microlitros de las diluciones requeridas en placas de agar BCYE e incube las placas durante tres días.

Cuente visualmente las colonias formadas a simple vista y realice cálculos de acuerdo con el protocolo de texto.