JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 3:12 min • August 29th, 2025
Tome un cultivo de Staphylococcus aureus, una bacteria con una pared celular gruesa de peptidoglicano.
Diluya el cultivo en medios frescos que contengan antibióticos e incube a una temperatura cálida agitando para promover el crecimiento bacteriano.
Transfiera el cultivo a un tubo y centríquelo para granular las bacterias.
Deseche el sobrenadante y coloque el gránulo en hielo para proteger las bacterias del daño.
Vuelva a suspender el gránulo en tampón de lisis y transfiéralo a un tubo que contenga perlas de sílice.
Inserte el tubo en un instrumento mecánico de lisis celular e inicie la agitación.
Las colisiones rápidas entre las bacterias y las perlas generan fuerzas de cizallamiento. Esto lisa las bacterias, liberando ADN, ARN y complejos ARN-proteína.
Los iones en el tampón de lisis estabilizan las estructuras de ARN, mientras que los agentes reductores en el tampón inactivan las enzimas que degradan el ARN.
Ahora, centrifuga la mezcla nuevamente para granular los escombros.
Recolecte el sobrenadante que contiene ácidos nucleicos y proteínas para su posterior análisis.
Cultive una colonia de cepas que transporten pCN51 P3 MS2 sRNA o plásmidos pCN51 P3 MS2 en tres mililitros de medio BHI suplementado con 10 microgramos por microlitro de eritromicina por duplicado.
Diluir cada cultivo nocturno en 50 mililitros de medio BHI fresco suplementado con eritromicina para alcanzar un DO 600 de 0,05. Cultive los cultivos a 37 grados centígrados agitando a 180 RPM durante seis horas. Transfiera cada cultivo a un tubo centrífugo de 50 mililitros y centrifugue los tubos a 2, 900 veces G durante 15 minutos a cuatro grados Celsius, luego deseche el sobrenadante, congélelos y guárdelos a menos 80 grados Celsius o mantenga los gránulos en hielo y realice directamente la lisis celular mecánica.
Para realizar la lisis celular mecánica, resuspenda los gránulos en cinco mililitros de tampón A y transfiera las celdas resuspendidas a tubos de centrífuga de 15 mililitros con 3,5 gramos de perlas de sílice. Inserte los tubos en un instrumento mecánico de lisis celular y ejecute un ciclo de 40 segundos a cuatro metros por segundo. Centrifugar los tubos a 2.900 veces G durante 15 minutos, luego recuperar el sobrenadante y mantenerlo en hielo.
Asegúrese de que el sobrenadante sea transparente, repitiendo la centrifugación si no lo está.