Aislamiento de ARN diana bacteriano unido a ARN regulador pequeño mediante purificación por afinidad

Tome un lisado de células bacterianas que contenga componentes celulares, incluido el ARNs marcado con MS2 unido a su ARN objetivo.

El ARNs marcado con MS2 es un ARN regulador pequeño diseñado que lleva un bucle de tallo de aptámero MS2 en su extremo 5 ', que exhibe una alta afinidad por la proteína de la cubierta viral MS2.

Transfiera el lisado bacteriano a una columna de cromatografía de afinidad preequilibrada que contenga resina de amilosa unida a proteínas de fusión compuestas por proteína de unión a maltosa (MBP) y la proteína de recubrimiento MS2.

La proteína de la cubierta de MS2 inmovilizada captura específicamente el bucle del tallo del aptámero del ARNs marcado con MS2, reteniendo el ARNs objetivo unido al ARN intacto.

Las moléculas no etiquetadas que permanecen sin unir se recogen en el flujo continuo.

Lave la columna con tampón para eliminar las moléculas residuales no unidas.

Eluir con un tampón que contenga maltosa, que desplaza a MBP de la resina, liberando el ARNs marcado con MS2 unido a su ARN diana.

Recolecte y almacene las fracciones en hielo para preservar la integridad del ARN para el análisis posterior.

Retire la punta de la columna, luego coloque una columna de cromatografía en una gradilla de columna y lave la columna con agua ultrapura. Agregue 300 microlitros de resina de amilosa y lave la columna con 10 mililitros de tampón A. Diluya 1, 200 picamoles de proteína MBP-MS2 en seis mililitros de tampón A y cárguelo en la columna.

Lave la columna con 10 mililitros de tampón A.A continuación, realice la purificación por afinidad MS2. Cargue el lisado de células en la columna y recoja la fracción de flujo continuo en un tubo de recolección limpio. Lave la columna tres veces con 10 mililitros de tampón A y recoja la fracción de lavado, luego eluya la columna con un mililitro de tampón E y recoja la fracción de elución en un microtubo de dos mililitros.

Mantenga todas las fracciones recolectadas en hielo hasta la extracción del ARN.