Un método de microdilución en caldo para pruebas de susceptibilidad a antibióticos de bacterias grampositivas

Aísle las colonias bacterianas grampositivas de una placa de cultivo y suspenderlas en un medio.

Diluya la suspensión para lograr la concentración bacteriana óptima para el ensayo.

Inocular los pocillos de prueba de una microplaca que contenga concentraciones crecientes de un antibiótico lipoglicopéptido y un pocillo de control de crecimiento que contenga solo el medio.

Extienda una alícuota del pocillo de control sobre las placas de cultivo para verificar la pureza del cultivo y el recuento de bacterias.

Incubar para permitir el crecimiento bacteriano, durante el cual se sintetiza la pared celular.

El antibiótico se une al peptidoglicano, un componente de la pared celular, y a sus precursores, inhibiendo la polimerización y debilitando la pared.

La interrupción permite que la presión osmótica provoque la lisis celular.

Después de la incubación, confirme la pureza del cultivo y el recuento bacteriano óptimo.

Inspeccione los pozos en busca de crecimiento bacteriano.

El pocillo de control muestra un crecimiento visible, mientras que el pocillo de prueba con la concentración de antibióticos más baja que inhibe completamente el crecimiento indica la concentración inhibitoria mínima (CIM).

En esta demostración, se inoculará una placa recién preparada. Para preparar el inóculo, seleccione varias colonias bien aisladas de un agar sanguíneo de 18 a 24 horas u otra placa de agar no selectiva. En este caso, se utilizan cepas de control de calidad de S. aureus y E. faecalis.

Toque la parte superior de cada colonia con un hisopo estéril y transfiera parte de él a un tubo que contenga de uno a cinco mililitros de CAMHB o solución salina. Siga transfiriendo hasta que la turbidez coincida con un estándar de 0.5 McFarland dentro de los 15 a 30 minutos posteriores a la preparación, diluya el inóculo de uno a 100 en CAMHB para llegar a una concentración final de cinco veces 10 a la quinta UFC por mililitro. El rango aceptable es de dos a ocho veces 10 a la quinta UFC por mililitro.

Inmediatamente, utilizando una pipeta multicanal con puntas estériles, transfiera 50 microlitros del inóculo final a cada pocillo apropiado de la placa del panel MIC. Aquí, se inoculan cuatro filas con cada uno de los dos aislados para un total de cuatro réplicas por aislado. A continuación, para realizar una comprobación de pureza, utilice una pipeta para transferir de uno a 10 microlitros de la solución en el control de crecimiento positivo a un agar no selectivo, como el agar de soja tripticasa con un 5% de sangre de oveja.

Use un asa estéril para esparcir la solución sobre la superficie de la placa. Gire la placa 90 grados y vuelva a rayar para asegurarse de que el inóculo se distribuya uniformemente. Cubre el plato y déjalo a un lado.

En preparación para un recuento de colonias, use una pipeta de un solo canal para transferir 10 microlitros de la solución en el pozo de control de crecimiento a 10 mililitros de mezcla salina, y luego transfiera 100 microlitros a un medio de agar no selectivo adecuado, como agar de soja tripticasa con 5% de sangre de oveja usando un asa estéril, extienda la solución por toda la superficie del agar. Repita este proceso dos veces en diferentes direcciones para asegurar una distribución uniforme del inóculo. A continuación, apile hasta cuatro paneles MIC en un recipiente de plástico asegurándose de que el panel superior esté bien sellado con una tapa.

Luego coloque una toalla de papel húmeda dentro del recipiente de plástico y ciérrelo firmemente con la tapa dentro de los 30 minutos posteriores a la inoculación. Incube los paneles de MIC, la placa de recuento de colonias y la placa de control de pureza en una incubadora de aire ambiente a 35 más o menos dos grados Celsius durante 16 a 20 horas. Al día siguiente, lea la concentración inhibitoria mínima como la concentración más baja que inhibe completamente el crecimiento bacteriano en los pocillos detectado a simple vista.

Determine el número de colonias en la placa de conteo de colonias. Multiplica el número contado por el factor de dilución. Por ejemplo, 50 colonias por un factor de dilución de 10,000 equivalen a cinco veces 10 a la quinta UFC por mililitro.

Un rango aceptable es de 20 a 80 colonias, lo que equivale a dos a ocho veces 10 a la quinta colonia formando unidades por ml. La concentración del inóculo es una variable importante para controlar las pruebas de susceptibilidad con el fin de obtener resultados precisos. Finalmente, verifique la placa de pureza.

Si todas las colonias son similares a las colonias utilizadas como inóculo, entonces se puede considerar puro. Si hay otras colonias presentes, existe la posibilidad de que haya un contaminante presente en el panel de CMI y se debe repetir la prueba.