JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 2:58 min • August 29th, 2025
Tome un portaobjetos con cámara que contiene células epiteliales humanas con endosomas marcados con fluorescencia.
Introducir bacterias patógenas intracelulares e incubar, permitiendo que se adhieran a las células.
Las bacterias inyectan proteínas que reorganizan el citoesqueleto del huésped, formando protuberancias de membrana que internalizan las bacterias en vacuolas.
Estas vacuolas extienden proyecciones tubulares que se conectan al sistema endolisosomal, una red de vesículas y orgánulos que regulan el tráfico intracelular.
Estas proyecciones redirigen el transporte de vesículas y remodelan el sistema endolisosomal.
Lavar para eliminar las bacterias extracelulares, luego incubar con un medio que contenga antibióticos para eliminar cualquier bacteria restante.
Reemplácelo con un medio de imagen sin suero que contenga el antibiótico y agregue nanopartículas marcadas con un fluoróforo contrastante.
Incubar para permitir la entrada de nanopartículas a través de la endocitosis y la acumulación en las vesículas remodeladas.
Lave para eliminar las nanopartículas no internalizadas, luego incube en un medio de imagen suplementado con suero.
Las nanopartículas fluorescentes y los endosomas marcados permiten la visualización de la remodelación endolisosomal inducida por bacterias.
Para comenzar este procedimiento, mida el OD 600 de las bacterias subcultivadas y diluya a un OD 600 de 0.2 en un mililitro de PBS, agregue cantidades apropiadas de bacterias a las células HeLa en el portaobjetos de la cámara de 8 pocillos para lograr una multiplicidad de infección de 100. Incubar durante 30 minutos en la incubadora de células.
Lave las células HeLa tres veces con PBS para eliminar las bacterias no internalizadas. Este punto de tiempo se establece como hora cero después de la infección o hora cero p.i. Añadir 300 microlitros de medio de cultivo fresco que contenga 100 microgramos por mililitro de gentamicina a las células y mantener durante una hora.
Después de una hora, reemplace el medio con un medio de imagen que contenga 10 microgramos por mililitro de gentamicina. Agregue NP de oro-BSA-rodamina a las células HeLa para obtener una concentración final de OD 520 de 0.1.
Incubar durante una hora. Después de una hora, retire el medio y lave tres veces con PBS. Finalmente, agregue 300 microlitros de medio de imagen fresco que contenga 10 por ciento de FCS y 10 microgramos por mililitro de gentamicina durante el resto del tiempo de incubación.