Cultivo de Mycobacterium tuberculosis en condiciones limitadas por el hierro

Comience con una placa de agar que contenga colonias de Mycobacterium tuberculosis cultivadas en un medio enriquecido con nutrientes.

Inocular una sola colonia en un caldo suplementado con nutrientes e incubar con agitación para un crecimiento uniforme.

Permita que el cultivo alcance la fase logarítmica tardía, donde las células son metabólicamente activas.

Pipetear un pequeño volumen en una placa de agar enriquecida, extenderlo uniformemente e incubar hasta que se forme una capa bacteriana continua.

Humedezca un hisopo estéril con un medio mínimo bajo en hierro (LIMM) y recoja las bacterias.

Suspenderlos en un recipiente de plástico que contenga LIMM para evitar la contaminación por hierro.

Agregue un agente dispersante para evitar la formación de grumos e incube sin agitar.

En condiciones limitantes de hierro, las bacterias activan respuestas al estrés y producen sideróforos en el citoplasma.

Estos se empaquetan en vesículas extracelulares y se liberan en el entorno.

Los sideróforos capturan hierro y ayudan a las bacterias a sobrevivir.

Este sistema destaca la adaptación y supervivencia de las micobacterias en condiciones limitadas por el hierro

Inocular una sola colonia de MTB en dos mililitros de medio de caldo micobacteriano suplementado con enriquecimiento de ADN. Incubar con agitación a 37 grados centígrados. Cuando haya crecimiento visible, extraer dos mililitros del cultivo y medir el OD 540 en un espectrofotómetro.

Detenga la incubación cuando el OD 540 alcance 0,8, lo que indica la fase logarítmica tardía. Extienda 200 microlitros del cultivo logarítmico tardío en las placas de agar micobacteriano suplementadas con 0,2 glicerol, 0,5% Tween 80 y ADN. Inocular al menos cinco placas.

Incube las placas a 37 grados centígrados. Y después de una semana, el crecimiento bacteriano es visible como una capa confluente. Luego humedezca un hisopo de algodón estéril en un medio mínimo de plancha baja.

Use este hisopo para recolectar bacterias de las placas de agar. Inocular las bacterias en 100 mililitros de medio mínimo bajo en hierro en un tubo. Recolecte suficientes bacterias para preparar una suspensión con un OD 540 de uno.

Diluir la suspensión 10 veces a un litro con bajo contenido de hierro mínimo medio y dividirla en dos botellas de plástico estériles. A continuación, transfiera dos mililitros del cultivo a un tubo de cultivo de cinco mililitros. Añadir 10 microlitros de tyloxapol al 10% volumen por volumen.

Incubar los cultivos a 37 grados centígrados durante 14 días.