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Tome un cultivo de Mycobacterium tuberculosis cultivado en un medio limitante de hierro para mejorar la secreción de vesículas extracelulares que contienen sideróforos, un quelante del hierro.
Centrifugar para peletizar las bacterias.
Recoge el sobrenadante y fíltralo para eliminar las bacterias residuales.
Transfiera el filtrado a un sistema de ultrafiltración agitada y un filtro para eliminar el exceso de medios y concentrar los vehículos eléctricos.
Centrifugar el concentrado para granular los desechos celulares.
Transfiera el sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga y centrífuzcalo para recoger el gránulo EV.
Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en un tampón y mézclelo con un medio de gradiente de densidad concentrado para formar la capa inferior.
Superponga con concentraciones decrecientes del medio de gradiente para crear un gradiente de densidad discontinuo.
Agregue tampón en la parte superior y centrifuge. Los vehículos eléctricos migran a la capa que coincide con su densidad flotante.
Recoja cada fracción en un tubo separado.
La fracción purificada con VE que contienen sideróforos está lista para estudios posteriores.
Transfiera el cultivo a cinco tubos de centrífuga cónicos de 225 mililitros y centrifugue a 2.850 veces g durante siete minutos a 20 grados centígrados. Recoger el sobrenadante de cultivo con una pipeta de 50 mililitros y esterilizarlo por filtro a través de un filtro de 0,22 micras.
Para aislar los MEV, transfiera el filtrado de cultivo a un sistema de ultrafiltración de células agitadas colocado a cuatro grados Celsius y filtre el concentrado a una presión inferior a 50 PSI a través de una membrana de corte de 100 kilodalton. A continuación, centrifugar el filtrado de cultivo concentrado a 15.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante en tubos de ultracentrifugación de policarbonato. Centrifugar el sobrenadante a 100.000 veces g durante dos horas a cuatro grados centígrados.
Después de eso, retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos membranosos en un total de un mililitro de PBS estéril mediante un pipeteo suave. Mezcle 0,5 mililitros de la suspensión de gránulos con 1,5 mililitros de solución de yodixanol al 60% en el fondo de un tubo de ultracentrífuga de polipropileno de paredes delgadas. Superponga esta suspensión MEV de yodixanol al 45% con un mililitro de soluciones de yodixanol al 40%, 35%, 30%, 25% y 20% y un mililitro de PBS en la parte superior.
Centrifugar a 100.000 veces g durante 18 horas a cuatro grados centígrados. Luego, use una jeringa Hamilton de un mililitro para recolectar las fracciones de gradiente de densidad de un mililitro comenzando desde la parte superior. Diluir cada fracción recolectada a 20 mililitros con PBS y centrifugar a 100,000 veces g durante dos horas a cuatro grados centígrados.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 0,5 mililitros de PBS.