Aislamiento de vesículas extracelulares bacterianas mediante cromatografía de exclusión por tamaño

0 views • 3:24 min • September 26th, 2025

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Tome una cromatografía de exclusión de tamaño o una columna SEC llena de perlas de resina porosa de tamaño definido. Contiene un depósito de muestra en la parte superior.

Agregue solución salina tamponada con fosfato o PBS para equilibrar las perlas de la columna y deseche el flujo continuo.

Cargue un filtrado de cultivo bacteriano concentrado que contenga vesículas extracelulares o EV, proteínas secretadas y contaminantes.

Los VE son nanovesículas a base de lípidos que transportan moléculas bioactivas y son secretadas por bacterias.

Una vez que el filtrado ingrese a las perlas, agregue PBS para conducirlo a través del lecho de resina.

Deseche el eluido inicial que contiene contaminantes no vesiculares grandes.

Coloque un tubo de recolección debajo de la salida y agregue PBS secuencialmente.

Los vehículos eléctricos de gran tamaño evaden los poros de resina más pequeños, se mueven a través de los espacios entre partículas entre las perlas y eluyen primero.

Las proteínas y contaminantes más pequeños ingresan a los poros, siguen caminos más largos y se eluyen más tarde.

Recolecte las fracciones de elución temprana que contienen EV y guárdelas para su análisis.

Para el aislamiento de los EV, realice cromatografía de exclusión por tamaño, o SEC, utilizando una columna pequeña con un volumen de lecho de 10 mililitros para menos de 100 mililitros de material de partida y una columna más grande con un volumen de lecho de 47 mililitros para más de 100 mililitros de material de partida. Durante varias horas antes del experimento, lleve la columna SEC y el PBS a temperatura ambiente, seguido de estabilizar la columna en posición vertical utilizando un soporte de laboratorio estándar. Antes de conectarlo a la columna SEC, hidrate el depósito de muestra dejando que cinco mililitros de PBS fluyan a través de la frita hacia un contenedor de desechos.

Luego, desenrosque la tapa de entrada de la columna para agregar dos mililitros de PBS al depósito de muestra y conecte con cuidado el depósito a la columna mientras el PBS gotea a través de la frita. Para equilibrar la columna, agregue 47 mililitros de PBS al depósito de muestra, seguido de destapar la parte inferior de la columna SEC. Luego, permita que todo el búfer de muestra cargado fluya a través de la columna y deseche el flujo continuo.

Después de cargar dos mililitros de la muestra en el depósito de muestras, deje que la muestra ingrese completamente a la columna y recoja el flujo. Agregue inmediatamente PBS al depósito de muestra a un volumen de 14,25 mililitros menos el volumen de la muestra para permitir que la solución fluya a través de la columna, mientras desecha la cantidad igual al volumen vacío de la columna. A continuación, coloque un microtubo de baja unión de dos mililitros directamente debajo de la columna SEC para recoger el primer flujo o fracción uno después de permitir que dos mililitros de PBS pasen por la columna.

Continúe agregando dos mililitros de PBS al depósito de muestra para recolectar cada fracción posterior. Almacene las fracciones recolectadas a cuatro grados Celsius para almacenamiento a corto plazo o menos 80 grados Celsius para almacenamiento a largo plazo.

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Cromatografía de exclusión de tamaño para analizar la heterogeneidad de las vesículas de la membrana externa bacteriana

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Last updated: 18 July 2026