Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:05 min. • September 26th, 2025
Comience con pocillos que contengan células T CD4+ que expresen receptores específicos del péptido ovoalbúmina u OVAp.
En el pozo de control negativo, coloque un inserto de membrana porosa.
En un tubo, tome células dendríticas infectadas con bacterias y cargadas con OVAp para su presentación superficial.
Agregue células dendríticas directamente en el pocillo de prueba y en el inserto en el pocillo de control negativo.
Agregue medios a los pocillos e incube.
En el pozo de prueba, las células interactúan para formar una sinapsis inmunológica, lo que facilita la transferencia bacteriana de la célula dendrítica a la célula T, un proceso conocido como transinfección.
En el pozo de control negativo, la barrera de membrana impide la interacción célula-célula, inhibiendo así la transinfección.
Agregue el antibiótico gentamicina a los pocillos e incube.
La gentamicina no puede penetrar en las células eucariotas, por lo que solo mata a las bacterias no internalizadas, mientras que las bacterias internalizadas sobreviven.
La muestra de prueba que contiene células T infectadas y la muestra de control con células T no infectadas ahora están listas para el aislamiento de células T y la cuantificación de la transinfección.
A una placa de cultivo de 24 pocillos, agregue dos millones de células T CD4+ en un volumen de 0,5 mililitros a cada uno de los cinco pocillos.
A continuación, para controlar el contacto físico, coloque barreras transpocillos de policarbonato con un tamaño de poro de tres micrómetros en el tercer y cuarto pozo. Al primer pozo, agregue 0,1 mililitros de las células dendríticas sobrecargadas infectadas. Al segundo pocillo, agregue 0,1 mililitros de las células dendríticas infectadas no cargadas.
Agregue 0,1 mililitros de las células dendríticas sobrecargadas infectadas a un pocillo y 0,1 mililitros de las células dendríticas infectadas no cargadas en el otro pocillo. Finalmente, como control negativo, infectar directamente el quinto pocillo de células T CD4+ a un MOI de 10. Luego, lleve el volumen total del pozo a 0,6 mililitros con RPMI.
Incube la placa durante 30 minutos para permitir que se formen sinapsis inmunes. Después de la incubación, agregue 100 microgramos de gentamicina por mililitro de medio a cada pocillo e incube durante una hora. La gentamicina es un antibiótico aminoglucósido que no puede penetrar en las células eucariotas.
Por lo tanto, en este paso, el aminoglucósido matará a las bacterias extracelulares pero no a las intracelulares.