JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 2:48 min • September 26th, 2025
Tome una cubeta que contenga una solución de trabajo de tioflavina T, un colorante fluorescente específico de amiloide, disuelto en solución salina tamponada con fosfato.
Coloque la cubeta en un espectrofluorómetro y registre la señal de fluorescencia de referencia.
Pausa la exploración y retira la cubeta.
Agregue el sobrenadante de cultivo esterilizado por filtro recolectado de células endoteliales pulmonares infectadas con bacterias virulentas de Pseudomonas .
El sobrenadante contiene agregados amiloides, que son proteínas mal plegadas y ricas en láminas beta.
Mezcle suavemente el contenido por inversión para asegurar una distribución uniforme.
Vuelva a cargar la cubeta en el espectrofluorómetro y reanude el escaneo para adquirir una señal de fluorescencia basada en el tiempo.
La tioflavina T se une específicamente a los amiloides ricos en láminas beta, lo que conduce a una mayor fluorescencia.
Realice un escaneo de fluorescencia con la misma configuración.
Un aumento en la fluorescencia en relación con la línea de base indica la presencia y abundancia relativa de amiloides inducidos por infección en el sobrenadante de cultivo.
Para cuantificar los amiloides dentro del sobrenadante, agregue 20 microlitros de solución madre de tioflavina T 50X recién preparada y filtrada a un mililitro de PBS en una cubeta de espectrofotómetro de un mililitro y cargue la muestra diluida en un espectrofluorómetro.
Mida la emisión de fluorescencia de referencia utilizando una excitación de 425 nanómetros. Escaneo de la emisión de fluorescencia de 450 a 575 nanómetros en incrementos de dos nanómetros. A continuación, configure el instrumento para realizar un escaneo de lapso de tiempo utilizando una excitación de 425 nanómetros y una emisión de 482 nanómetros con adquisición de datos cada 0,2 segundos durante 60 segundos.
Pausa la exploración después de 20 segundos y añade 10 microlitros de sobrenadante esterilizado por filtro a la cubeta. Después de mezclar por inversión, vuelva a cargar la cubeta en el espectrofluorómetro y reanude el escaneo basado en el tiempo durante los últimos 40 segundos. Una vez finalizado el lapso de tiempo, realice un escaneo final del espectro de emisiones de fluorescencia utilizando la configuración de escaneo original.