Seguimiento de la dinámica de la infección bacteriana en un ratón mediante bioluminiscencia

Comience con una suspensión de una cepa atenuada de una bacteria patógena.

La cepa atenuada muestra una patogenicidad reducida debido a deleciones específicas en genes de virulencia.

Las bacterias están marcadas cromosómicamente con un operón bioluminiscente que permite la producción autónoma de luz.

Las bacterias expresan el operón bioluminiscente, produciendo una enzima luciferasa y un complejo enzimático que sintetiza el sustrato de luciferasa.

La luciferasa oxida el sustrato para producir luz visible.

Centrifugar la suspensión y desechar el sobrenadante.

Lave las células con un tampón, centrifugue nuevamente y deseche el sobrenadante para eliminar los componentes no celulares residuales.

Vuelva a suspender las células en el tampón para lograr una concentración bacteriana óptima y extraiga la suspensión en una jeringa.

Inyecte la suspensión por vía intraperitoneal en un ratón, luego transfiérala a una jaula.

Visualice la señal bioluminiscente a intervalos regulares.

La cepa atenuada permanece localizada y la bioluminiscencia disminuye gradualmente, lo que indica la eliminación de la infección.

En la mañana de las inyecciones, descongele los crioviales de las células bacterianas a cuatro grados centígrados durante tres o cuatro horas. Mantenga los viales en hielo después de descongelarlos e inyecte a los ratones dentro de las dos horas. Transfiera el contenido de cada criovial a un nuevo tubo de dos mililitros y centrifugue a 4.500 veces G durante 10 minutos.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en un mililitro de PBS. Repita la centrifugación y vuelva a suspender las células en PBS a una concentración final de 2,5 veces 10 a la novena colonia formando unidades por mililitro. Tome tres muestras de la suspensión final de cada cepa para validar la concentración, el genotipo y el fenotipo.

Para cada cepa, alícuota 1,5 mililitros de la suspensión celular en un tubo de dos mililitros y prepare el PBS para las inyecciones de control. Reúna los ratones y los materiales necesarios para las inyecciones en una sala quirúrgica de animales estériles y limpie todas las superficies con toallitas desinfectantes antes de comenzar. Use dos pares de guantes de látex para limitar el riesgo de pinchazos, si es mordido, así como una bata de laboratorio, gafas de seguridad y mascarilla.

Retire el ratón de la jaula y péselo, marcando la cola con un marcador permanente para el seguimiento posterior a la inyección. Abra una nueva jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 27 y extraiga 200 microlitros de PBS estéril. Agarra el ratón detrás de las orejas, con el pulgar y el índice, y pellizca para crear un pliegue cutáneo en la nuca.

Luego, asegure la cola en la palma usando el meñique para mantener al ratón plano e inmóvil. Inserte la aguja en un ángulo de 30 grados en la cavidad peritoneal a la izquierda o derecha de la línea media. Levante ligeramente la aguja para asegurarse de que no se insertó en los órganos.

Luego, inyecte lentamente el PBS y retire la aguja. Un bolo en el lugar de la inyección es típico. Coloque la aguja en el recipiente designado para desechar objetos punzantes y mueva el ratón a una jaula separada.

Repita el procedimiento con el siguiente ratón y después de inyectar todos los ratones de una jaula, muévalos de regreso a su jaula original. Después de inyectar el grupo de control, inyecte los grupos de prueba utilizando el mismo procedimiento. Una vez que se completen todas las inyecciones, regrese a los ratones a la sala de alojamiento y limpie el área de trabajo con toallitas desinfectantes.

Ajuste el flujo de oxígeno a 1,5 litros por minuto y el isoflurano al 3,5% y mueva el ratón a la cámara de anestesia, luego a la etapa de temperatura estabilizada, después de la anestesia. Coloque el ratón boca arriba con los brazos extendidos y coloque un cono nasal para la administración de isoflurano al 2,5% durante la obtención de imágenes.

Cierre la puerta y tome imágenes bioluminiscentes y radiografías del ratón. Cuando se completen las imágenes, devuelva el ratón a su jaula y vigílelo. Debería recuperar la conciencia en tres a cinco minutos.