Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 2:27 min. • September 26th, 2025
Comience con un cultivo de Pseudomonas aeruginosa recombinante en un medio de selección de antibióticos.
Estas bacterias albergan un plásmido no replicativo integrado en el genoma cerca del gen diana bacteriano destinado a la eliminación.
La integración se produjo a través de secuencias homólogas compartidas entre el plásmido y el genoma, lo que resultó en una única recombinación cruzada.
El plásmido codifica un gen de resistencia a los antibióticos y el gen sacB , que confiere sensibilidad a la sacarosa.
Vierta las bacterias en un medio que contenga sacarosa pero que carezca del antibiótico e incube.
Sin presión antibiótica, se produce una segunda recombinación, o un doble cruce, entre regiones homólogas, extirpando el plásmido y el gen diana.
Durante la multiplicación bacteriana, el plásmido extirpado no se transmite, lo que hace que las bacterias sean tolerantes a la sacarosa.
Coloca las bacterias en un medio no selectivo y en un medio que contenga sacarosa o el antibiótico, e incuba.
El crecimiento en los medios no selectivos y sacarosa, pero no en el medio antibiótico, confirma un doble cruce exitoso.
Comience cultivando colonias recombinantes de un solo cruce en caldo de aislamiento de Pseudomonas o PIB. Inocular y rayar 10 microlitros de cada cultivo en placas PIA precalentadas, complementadas con sacarosa al 10%. Luego incube las placas durante la noche a 37 grados centígrados.
Al día siguiente, retire las placas de la incubadora e inspecciónelas para ver si crecen. La colonia resistente a la sacarosa debe ser recombinante de doble cruce. Use palillos de dientes estériles para parchear al menos 20 colonias en placas precalentadas de PIA, PIA suplementada con sacarosa al 10% y PIA suplementada con carbenicilina.
Incube las placas durante la noche y examínelas para ver si crecen al día siguiente. Los verdaderos recombinantes de doble cruce serán sensibles a la carbenicilina y resistentes a la sacarosa.