Imágenes de lapso de tiempo de fluorescencia del ciclo de vida de Streptomyces venezuelae

Tome una placa microfluídica con un pozo que contenga esporas de Streptomyces venezuelae, una bacteria formadora de hifas.

Otros pozos designados contienen medio rico en nutrientes o gastado.

Las esporas se derivan de una cepa que expresa proteínas fluorescentes DivIVA y FtsZ, que se localizan en las puntas de las hifas y las paredes transversales, respectivamente.

Aplique aceite de inmersión a la lente del objetivo de un microscopio invertido y a la ventana de imágenes de la placa.

Monte la placa en la platina del microscopio y comience a tomar imágenes de lapso de tiempo.

Cargue las esporas en la cámara de cultivo de la placa.

Luego, introduce el medio rico en nutrientes para iniciar la germinación de las esporas.

A medida que las hifas crecen, DivIVA se acumula en las puntas de las hifas, mientras que FtsZ forma anillos dispersos en las paredes transversales.

A continuación, cambie al medio gastado. La falta de nutrientes en este medio favorece la esporulación.

En las hifas que brotan, los focos de DivIVA desaparecen y FtsZ se reorganiza en una escalera regular de anillos de división, formando septos de esporulación.

Con el tiempo, la desaparición de la fluorescencia de FtsZ en las mismas hifas confirma la finalización de la esporulación.

Precaliente la cámara ambiental a 30 grados centígrados con anticipación.

Luego encienda el microscopio y el software de control del microscopio. Coloque un objetivo de inmersión en aceite de alta apertura numérica en su lugar y confirme que los filtros apropiados y los espejos diagramáticos configurados para adquirir imágenes de contraste de interferencia diferencial, junto con las imágenes de las fusiones de proteínas fluorescentes amarillas y rojas, estén en su lugar. Coloque una gota de aceite de inmersión en el objetivo y también en la parte inferior de la ventana de imágenes en la placa microfluídica.

Monte con cuidado el dispositivo microfluídico sellado en la platina del microscopio invertido y asegúrelo en su lugar. Utilice los marcadores de posición integrados para enfocar la ventana de imágenes de la cámara de cultivo microfluídico. Concéntrese en la parte más a la izquierda de la primera cámara de flujo etiquetada como A y luego mueva la platina al tamaño de trampa cinco, correspondiente a la altura de la trampa de 0,7 micrómetros.

En el software microfluídico, configure el sistema para cargar celdas desde el pozo de entrada ocho a cuatro psi durante 15 segundos. Una vez ejecutado el proceso, verifique la densidad celular en la cámara de cultivo moviendo la platina a través de la ventana de imágenes. Si no se atraparon esporas, repita el paso de carga celular o, alternativamente, aumente la presión y/o el tiempo de carga hasta que se logre la densidad celular deseada de una a 10 esporas por ventana de imagen.

Tenga cuidado de no sobrecargar la cámara de cultivo. A continuación, inicie el programa de flujo previamente preparado en el software de control y deje que la placa microfluídica se equilibre térmicamente durante una hora en la platina del microscopio antes de comenzar la adquisición de imágenes. En el software de control del microscopio, configure una adquisición multidimensional para tomar múltiples imágenes en múltiples posiciones de la etapa a lo largo del tiempo especificando primero un directorio para el guardado automático de los archivos de imagen.

A continuación, vaya a la configuración de iluminación e ingrese la configuración de iluminación óptima predeterminada para cada construcción específica. A continuación, configure una serie temporal para adquirir imágenes cada 40 minutos durante 24 horas. Para determinar las posiciones de la etapa y configurar el enfoque automático, escanee la cámara de cultivo y almacene las posiciones de la etapa para cada posición de imagen de interés.

Asegúrese de que las posiciones de una sola etapa estén lo suficientemente separadas para minimizar el fotoblanqueamiento y la fototoxicidad. Una vez verificadas las coordenadas Z de las posiciones de la platina seleccionadas, active el enfoque automático del hardware. A continuación, inicie el experimento de lapso de tiempo en el software de control del microscopio.

Detenga la adquisición de imágenes después de 24 a 30 horas, o cuando las hifas en la región de interés se hayan diferenciado en esporas. Luego detenga el programa de flujo en el software y desmonte el dispositivo microfluídico. Prepare la placa microfluídica usada para el almacenamiento a corto plazo eliminando cualquier medio restante de los pozos de entrada, el pozo de desechos y el pozo de carga de la celda.

Luego llene los pozos usados del carril A y los pozos de los carriles no utilizados con PBS estéril. Finalmente, selle el plato con film de pera para evitar que se seque. Y guarde el plato a cuatro grados centígrados.