JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 2:20 min • September 26th, 2025
Comience con una planta experimental con regiones foliares modificadas genéticamente que expresen grandes fragmentos no fluorescentes de proteína fluorescente verde superfolder o sfGFP.
Inyecte estas áreas modificadas con bacterias Pseudomonas que contienen proteínas efectoras marcadas con el pequeño fragmento no fluorescente de sfGFP.
Incubar para permitir la interacción entre las bacterias y las células de las hojas.
Usando un sistema de secreción especializado, Pseudomonas entrega las proteínas efectoras marcadas en el citosol de la hoja.
La proximidad entre los fragmentos de GFP grandes y pequeños permite su ensamblaje en sfGFP fluorescente funcional, que luego se transloca a la membrana plasmática.
Después de la incubación, extirpe los discos de las hojas de las áreas inyectadas.
Visualice estos discos con un microscopio confocal de barrido láser.
Inicialmente, obtenga imágenes del disco de la hoja a baja intensidad láser para minimizar la autofluorescencia. Luego, aumente la potencia del láser para mejorar la visibilidad.
La fluorescencia verde confirma la infección bacteriana exitosa y la entrega de proteínas efectoras en las células vegetales.
Para las hojas de Nicotiana benthamiana , infiltrar la suspensión de Pseudomonas en la misma área en la que se infiltró la Agrobacterium dos días antes.
Finalmente, corte un disco de hoja de las hojas inoculadas con Pseudomonas. En momentos específicos después de la infiltración de Pseudomonas, use un sistema de escaneo láser confocal para obtener imágenes de dos discos de hojas de dos centímetros cuadrados de una sola planta. Observe las células lejos del orificio de infiltración para evitar que las células muertas mueran por heridas.
Los efectores translocados de las bacterias están presentes solo en cantidades muy pequeñas. Por lo tanto, puede aumentar la potencia del láser y obtener una emisión de fluorescencia para detectar una señal fluorescente. Sin embargo, no domine para evitar capturar señales falsas de la autofluorescencia de las células vegetales.