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Tome un cubreobjetos con una capa de hidrogel fotodegradable que contenga colonias bacterianas atrapadas, modificadas genéticamente para emitir fluorescencia.
Coloque el cubreobjetos en un soporte.
Agregue medios para evitar la deshidratación de la muestra.
Bajo un microscopio de campo claro, concéntrese en una sola colonia de interés.
Usando el software apropiado, diseñe un patrón de luz para la extracción celular en la periferia de la colonia para romper los enlaces estructurales del hidrogel y minimizar la exposición a los rayos UV de las células.
Ajuste la intensidad de la luz ultravioleta y la duración de la exposición.
Inicie la exposición a la luz ultravioleta para romper los enlaces estructurales en el hidrogel en las áreas expuestas que facilitan la liberación de la colonia objetivo.
Usando un filtro de fluorescencia, identifique la colonia.
Coloque una punta de tubo en el lugar, con el otro extremo conectado a una jeringa.
Cambie al modo de campo claro y, con la jeringa, aspire la colonia liberada.
Transfiera la colonia a un tubo para un análisis más detallado.
Coloque la muestra en un soporte de PDMS y agregue el medio definido encima de la muestra para evitar la deshidratación de la muestra y proporcionar una solución portadora para las células liberadas. Después de colocar el espejo de calibración en su posición, ajuste el enfoque del microscopio para obtener una imagen nítida de las colonias dentro de la matriz de hidrogel o micropocillos e inspeccione para identificar colonias o pocillos de interés.
Aquí, diseñe los patrones de luz mientras la vista de la cámara muestra las colonias dentro de la muestra para probar diferentes patrones para la extracción celular y guardar el patrón definido. Luego seleccione la sección de control de sesión, agregue la secuencia guardada en la pestaña titulada con el nombre del producto de la herramienta de iluminación con patrón. Elija la opción para estimular el patrón para ver y ajustar la ubicación de exposición deseada.
A continuación, ajuste la intensidad de la luz al 60% y el tiempo de exposición a 40 segundos en la pestaña de control LED e inicie el proceso de exposición. Supervise la degradación del hidrogel en tiempo real y en modo de campo claro para garantizar la liberación de la celda. Para recolectar la célula liberada, cambie el filtro del microscopio de campo claro a TRITC para visualizar el área expuesta de la muestra a simple vista.
Una vez localizada la zona expuesta, coloque el extremo del tubo sobre el punto irradiado y, a continuación, vuelva a cambiar el filtro del microscopio a Brightfield para controlar la recuperación celular en tiempo real. Use la jeringa conectada al otro extremo del tubo para extraer con cuidado 200 microlitros de solución que contiene las células liberadas y transfiera la solución a un tubo centrífugo de 1,5 milímetros para análisis de ADN o siembra