Suministro localizado de bacterias en la luz intestinal de una larva de pez cebra mediante microinyección

Tome un plato que contenga una larva de pez cebra anestesiada.

Aplique una gota de agarosa de bajo punto de fusión sobre la larva y colóquela suavemente lateralmente para permitir el acceso intestinal durante la inyección.

Ahora, enfríe brevemente la agarosa para solidificarla, inmovilizando así la larva.

Agregue medios que contengan un agente anestésico para mantener la larva bajo anestesia.

A continuación, tome una suspensión de Clostridioides difficile marcada con fluorescencia, una bacteria patógena, y agregue un tinte trazador para facilitar el monitoreo de la inyección.

Cargue esta mezcla en una aguja de microinyección y monte la aguja en un micromanipulador.

Bajo un microscopio estereoscópico, coloque la aguja en un ángulo dirigido hacia el intestino larvario.

Luego, inserte suavemente la punta de la aguja en la luz intestinal.

Inyecte las bacterias directamente en el lumen y confirme la administración exitosa con el tinte trazador. Luego, retraiga la aguja.

Usando microscopía de fluorescencia, confirme la localización de Clostridioides difficile en el intestino larvario.

Primero, coloque una gota de agarosa de bajo derretimiento al 0,8% sobre las larvas de pez cebra en una placa de Petri para cubrir. Ajuste suavemente las larvas a una posición lateral. Coloque la placa de Petri en hielo durante 30 a 60 segundos para permitir que la agarosa de bajo derretimiento se solidifique.

Agregue un 30% de medio de Danieau que contenga entre un 0,02% y un 0,04% de tricaína para cubrir la agarosa. Para preparar la solución de inyección, agregue un microlitro de rojo de fenol al 0,5% en solución de PBS en nueve microlitros del inóculo de Clostridioides difficile teñido con colorante. Cargue una aguja de microinyección calibrada con la solución de inyección usando un Microloader.

Monte la aguja cargada en un micromanipulador y colóquela bajo un microscopio estereoscópico. Ajuste la presión de inyección entre 600 y 900 hectopascales. Ajuste el tiempo de inyección a 0,1 a 0,3 segundos para obtener de 0,5 a 1,0 nanolitros.

Coloque la aguja en el micromanipulador en un ángulo de aproximadamente 45 grados, apuntando hacia las larvas incrustadas. Coloque la punta de la aguja por encima del tracto gastrointestinal, cerca del poro urogenital. Perfore la agarosa y luego el músculo con la punta de la aguja.

Luego insértelo en la luz intestinal e inyecte de 0,5 a 1,0 nanolitros de Clostridioides difficile. Use un microscopio de fluorescencia para monitorear las larvas inyectadas y use una punta flexible de Microloader para recoger las larvas inyectadas correctamente para obtener imágenes confocales.