Preparación de esferoplastos de E. coli

0 vistas4:30 min • September 26th, 2025

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Tome un cultivo de E. coli .

Diluir el cultivo en medios frescos e incubarlo para promover la división bacteriana.

A continuación, diluya el cultivo en un medio que contenga un inhibidor de la división bacteriana e incube.

Las bacterias continúan creciendo sin dividirse, formando filamentos alargados.

Transfiera el cultivo a un tubo nuevo, luego centrifugue para granular los filamentos y eliminar el sobrenadante.

Lave el gránulo con un estabilizador osmótico para evitar la lisis de esferoplastos. Retire la solución.

Agregue tampón, lisozima, ADNasa y un agente quelante secuencialmente. Incubar.

El agente quelante desestabiliza la membrana externa del filamento.

La lisozima degrada la capa de peptidoglicano expuesta, lo que hace que los filamentos pierdan forma y formen estructuras esféricas llamadas esferoplastos.

Además, la ADNasa degrada el ADN contaminante liberado por los filamentos dañados.

Agrega el estabilizador osmótico nuevamente, mezcla e incuba.

Transfiera la suspensión a un tubo que contenga tampón y centrífuga.

Elimine el exceso de sobrenadante y vuelva a suspender los esferoplastos en el tampón para el análisis posterior.

Para configurar un cultivo durante la noche, use una punta de micropipeta estéril para transferir una sola colonia bacteriana de una placa de cultivo de agar sólido a un tubo de cultivo de 14 mililitros, que contiene de dos a tres mililitros de caldo de soja tripticasa al tres por ciento, TSB, para una incubación de 16 a 21 horas a 37 grados centígrados con agitación. Para preparar esferoplastos de E. coli gramnegativos, diluya el cultivo durante la noche en una proporción de uno a 100 y 25 mililitros de TSB en un matraz de 250 mililitros, y devuelva las bacterias a la incubadora agitadora durante otras 2,5 horas. Cuando la solución haya alcanzado una densidad óptica de 0,5 a 0,8 a 600 nanómetros, diluya el cultivo en una proporción de uno a diez en TSB fresco en un nuevo matraz de 250 mililitros para una segunda incubación de 2,5 horas con una concentración efectiva final de 60 microgramos por mililitro de cefalexina.

Producir filamentos unicelulares de aproximadamente 50 a 150 micrómetros de longitud, como se visualiza bajo un microscopio óptico con un aumento de 1000x. Centrifugar la solución bacteriana para cosechar los filamentos y decantar el sobrenadante. Lave los filamentos con la adición suave de un mililitro de sacarosa molar 0.8, teniendo cuidado de no alterar el gránulo.

Después de un minuto, deseche el sobrenadante sin alterar el sedimento y agregue los reactivos indicados en su orden respectivo a los filamentos. Después de diez minutos a temperatura ambiente, agregue gradualmente un mililitro de solución A durante un período de un minuto, mientras agita suavemente la solución con la mano. Incube la solución durante cuatro minutos a temperatura ambiente, luego divida la suspensión del filamento en dos alícuotas iguales entre dos tubos cónicos de 15 mililitros que contengan siete mililitros de solución B de cuatro grados Celsius. A continuación, peletice los filamentos por centrifugación y use una pipeta serológica para eliminar con cuidado todos menos uno o dos mililitros del sobrenadante sin alterar los gránulos.

Utilice una micropipeta p1000 para volver a suspender suavemente los gránulos. Verifique una pequeña alícuota de la muestra para la formación de esferoplastos mediante microscopía óptica. El esferoplasto se puede almacenar a menos 20 grados Celsius durante una semana o hasta que hayan pasado por tres ciclos de congelación y descongelación.

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Última actualización: 15 agosto 2026