JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 4:20 min • September 26th, 2025
Comience con una placa de pocillos múltiples que contenga medios de crecimiento preinoculados con bacterias productoras de celulosa.
En el pozo tratado, el medio se complementa con ácido 2-cloroetilfosfónico (CEPA).
Selle la placa para evitar el intercambio de gases e incube.
Durante la incubación, CEPA hidroliza y libera etileno, una molécula gaseosa.
El etileno activa la celulosa sintasa bacteriana, que utiliza la glucosa UDP citosólica para sintetizar celulosa.
Con el tiempo, las bacterias extruyen celulosa a través de su membrana.
Esto promueve el autoensamblaje bacteriano en la interfaz aire-líquido, formando una biopelícula flotante a base de celulosa o película.
Después de la incubación, transfiera las películas a una placa nueva de varios pocillos. Agregue una solución alcalina e incube a una temperatura más alta para lisar las células.
Retire la solución alcalina. Lave repetidamente con agitación para eliminar los desechos celulares mientras retiene la celulosa.
Secar y pesar las películas. Un mayor peso seco en las muestras tratadas con CEPA en comparación con el control indica una mayor producción de celulosa bacteriana en respuesta al etileno.
El ensayo de película es una herramienta de análisis estándar para la producción de celulosa bacteriana. El PH y el análisis morfológico se detallan en el protocolo de texto. En preparación, recolecte células de cultivos iniciadores por triplicado y cuantifique las células utilizando una cámara de recuento Petroff-Hauser.
Luego, prepare cuatro mezclas maestras medias con diferentes concentraciones de CEPA. Para cada mezcla maestra, alícuotas 60 mililitros de medio pH 7 SH y agregue 120 microlitros de solución madre de CEPA de 0, 5, 50 o 500 milimolares para obtener concentraciones finales de CEPA de 0, 0,01, 0,1 o 1,0 milimolar. Mezcle estos medios agitando los frascos.
Se necesita un conjunto de medios para cada uno de los triplicados y se necesita un cuarto conjunto para funcionar como control estéril. Por lo tanto, divida cada preparación de medio de 60 mililitros en cuatro alícuotas de 14 mililitros. Luego, enfríe previamente las alícuotas de 14 mililitros antes de inocular con sus respectivos cultivos iniciadores para obtener una concentración final de 100,000 células por mililitro.
Mantenga todos los tubos inoculados en hielo para evitar la producción de celulosa. Use las alícuotas restantes de 14 mililitros para pocillos de control estériles. Ahora, de cada mezcla maestra de 14 mililitros, cargue dos alícuotas de mililitros en seis pocillos de una placa estéril de 24 pocillos para un total de cuatro placas cargadas por cultivo iniciador analizado.
Selle cuidadosamente las placas con una película de parafina e incube estáticamente durante siete días a 30 grados centígrados. Para recoger una película de la placa, presione un lado de la película para elevar el borde opuesto y recójala con fórceps.
A continuación, transfiera individualmente las películas a los pocillos de una placa de seis pocillos. Trátelos con 12 mililitros de hidróxido de sodio normal 0,1 a 80 grados centígrados durante 20 minutos para lisar las células. Luego, retire el hidróxido de sodio y neutralice las películas tratadas lavándolas bien con 12 mililitros de agua ultra pura durante 24 horas con agitación en una placa de seis pocillos.
Durante esta incubación, cambie el agua cada seis horas. Cuando termine la incubación, las películas deben ser blancas. Luego, coloque las películas sobre esteras de silicona y séquelas a 50 grados centígrados durante 48 horas para prepararlas para la medición del peso seco.